第6章抗生素的生物合成课件.ppt
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- 抗生素 生物 合成 课件
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1、第六章第六章 抗生素的生物合成抗生素的生物合成及产生的遗传学及产生的遗传学.第一节第一节 研究方法研究方法 完整地阐明生物合成过程应包括:n(1)促成分子建成的初级代谢物结构单元的确立。n(2)代谢途径中中间产物的分离;这些产物的结构可能会提供关于反应次序问题的合理假设。n(3)催化每一个反应的酶的鉴定。n(4)操纵基因及其序列和组成的确定。.一、追踪技术一、追踪技术n为确定相应的结构单元,将所设想的抗生素前体用14C,3H或13C等同位素标记,再将其加入到产生菌的培养物中,最好是在生长后期加入。n经过一段时间的培养后,提取其中相应的抗生素,纯化,检测所掺入的同位素。n在使用放射性同位素进行标
2、记的过程中,常常需要对分子进行化学降解,以确定放射性同位素所掺入的组成该分子的原子。.13C标记前体n在利用13C标记前体时,掺入单个原子的情况可以通过产物的核磁共振(NMR)光谱来显示。n利用这项技术,分子中单个碳原子在共振光谱中以高峰出现,其高度与其中13C的含量几乎成正比。n标记物的渗入度可由所标记分子的峰值与天然产物的峰值之比来表示(13C的天然富足度为1.1)。.2-13C标记的乙酸掺入替考拉宁 n(A)通过常规发酵得出的替考通过常规发酵得出的替考拉宁拉宁13C-NMR光谱光谱(20-125 ppm带带);(B)通过通过2-13C标记的乙酸掺入发酵所得标记的乙酸掺入发酵所得出的替考拉
3、宁的光谱。可以看出的替考拉宁的光谱。可以看出,乙酸是二羟苯甘氨酸部分出,乙酸是二羟苯甘氨酸部分(小圆点小圆点)和脂肪酸链和脂肪酸链(大圆点大圆点)的前体物质。的前体物质。.2H标记前体物分子中两个相邻的原子n对核磁共振光谱峰及其偶合常数的多重性的高分辨分析,可以揭示出两个原子是否在整个代谢过程中都连结在一起,还是保持相对独立,或是通过不同的代谢途径掺入的。n通过利用氘标记的前体物的NMR的研究,同样可以获取重要的信息。与氢不同,氘在NMR中不会产生质子的共振信号。在生物合成反应机制的研究中,氘作为一种特殊的标记物质,在生物合成过程的反应位点上取代单个或多个氢原子。n在菌株培养过程中,这些中间产
4、物则转变为终产物分子。终产物分子的质子NMR可以显示在酶促反应中,该原子是否被保留或被取代。.二、中间代谢物的鉴定二、中间代谢物的鉴定n生物合成反应中某一步反应不能进行的突变株的分离,是用来鉴定合成途径中某些中间产物的一种普遍采用的适宜手段。这些被称为“阻断变株”的突变体,常导致培养基中那些无法参与下一步反应的底物的积累。n阻断变株可通过对产生菌进行诱变处理,然后分离出那些不具有产生抗生素能力的菌落而获得。n将这些变株一次两个在同一摇瓶内培养,发酵液进行抗菌活性的测定。.两种不同的突变株进行共培养n突变株单独培养时不能产生抗生素,但将两种不同的突变株进行共培养时,则可以产生抗生素,表明这两种突
5、变株的突变发生在生物合成途径中的两个不同的阶段。n其中一种变株所不能合成的中间物,可由另一种能积累该中间物的变株所提供,从而使抗生素合成的一系列反应得以进行。.所积累的产物可以被分离和鉴定n为证实这些产物的确是生物合成途径的中间产物,可以通过原始出发菌株,由这些中间产物转变为终产物的实验以进行评价。n例如,我们可以将中间产物加入到产生菌的细胞悬浮物中,几小时后,测定其中抗生素的生成量,再与对照组中合成抗生素的量进行比较。.三、酶的鉴定三、酶的鉴定n通过比较产抗生素株与不产抗生素变株中酶的活力,有时可以获取有关生物合成途径的一些信息。n产抗生素株中一种酶活力的存在,与阻断变株中该酶的缺失,即可有
6、力地证明这种酶在该生物合成途径中起着重要的作用。n在示踪技术和中间物的分离技术为生物合成次序的确定提供足够信息的基础上,有可能从酶的角度来研究单个合成反应。.四、遗传学与重组四、遗传学与重组DNA技术技术n在过去几年里,由于有关基因的克隆分析等一系列技术的应用,使次级代谢过程的生物合成和调节机制的研究取得了很大进展。n最初的研究发现,生物合成基因通常在染色体上成簇存在,在放线菌中尤其是这样。进一步研究又发现,在通常情况下,这些基因簇还包括调节基因和自身抗性基因。.确定生物合成基因两种不同策略 n1将某种抗生素产生菌(通常指放线菌)的其中一个基因文库转入到对该抗生素敏感的菌株中,筛选抗性克隆。从
7、这些抗性克隆中分离出编码自身抗性的基因,然后可以着手分离侧翼的结构基因。n2利用在相类似的生物合成途径中功能相似的基因通常具有的高度的同源性,可将相类似的生物合成途径的基因进行杂交。n生物合成基因确定后,将其核苷酸序列与数据库中已知的序列进行比较,可以揭示出基因产物的功能和特性,即其酶促作用和调节机能。而且,所推断的酶的氨基酸序列可能有助于我们了解生物合成反应的机制。.第二节第二节 生物合成反应与途径生物合成反应与途径n合成抗生素的酶促反应与生成初级代谢产物的中间代谢并非有根本的不同。n事实上,催化特殊代谢物合成的酶是由普通代谢中的酶进化而来。.抗生素生物合成的途径可分两大类n对初级代谢产物的
8、修饰反应。这类反应与初级代谢物的合成与分解反应相类似,例如象氨基酸或核苷酸的代谢反应。这些反应的产物可以是一种抗生素,或者是一种结构较为复杂的抗生素的组成成分。在初级代谢物中,有的分子由两个或两个以上的单位组成,如叶酸或辅酶A等。n2相似代谢物的聚合。通过这些反应,通常是先形成复杂而又关键的中间物,然后经过进一步修饰,生成具有活性的终产物分子。.叶酸叶酸NNNNOHH2NCH2NCONHCHCH2CH2COOHHCOOH12345678蝶啶焦磷酸酯蝶啶焦磷酸酯对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸谷氨酸谷氨酸对氨基苯甲酰谷氨酸对氨基苯甲酰谷氨酸蝶啶焦磷酸酯蝶啶焦磷酸酯.相似代谢物的聚合n(1)来源于聚酮体合
9、成的抗生素。其聚合反应机制与脂肪酸合成反应的机制相类似。n(2)肽类抗生素,由氨基酸缩合而成,其过程与聚酮体合成的过程相似。n(3)类异戊二烯类抗生素,由多个异戊二烯单位缩合而成。n(4)氨基糖苷类抗生素,由多个糖单位聚合而成,类似于多糖的合成过程。.一、初级代谢与次级代谢的关系一、初级代谢与次级代谢的关系n次级代谢物的大量生成与细胞的初级代谢相比发生了相当大的变化。这种变化体现在要为次级代谢物的生成提供物质和能量(ATP)以及还原性辅酶。n将产抗株(尤其是高产突变株)与不产抗株作比较,二者中与抗生素生物合成并无直接关系的酶的水平也可能存在实质性的不同。.二、抗生素二、抗生素“家族家族”的合成
10、的合成n一个微生物株系常常会产生几种代谢物,这些代谢物在其化学结构与生物学活性上相类似,因而共同组成一个抗生素“家族”。n家族化合物的生成并不仅仅局限于抗生素类,而是次级代谢的一个普遍特征,这一特征归因于酶对相应底物缺乏特异性。事实上,酶通常只识别底物分子的特异区。结构非常相似的比较大的分子,在与酶促作用位点无空间关系的区域内,存在一些细小的差异。这些大分子物质在相应的反应中,会被酶当作底物而识别。.抗生素家族的合成是由下列因素决定的n1.关键中间物通过上述某种途径而合成。n2.这一中间物通过通常的代谢反应修饰,如甲基化作用、羟基化作用等等。n3.同一种代谢物可以是能生成两种或两种以上产物的几
11、种反应的底物,这两种或两种以上的产物能被转化,因而形成代谢树(metabolic tree)。n4.由于底物明显缺乏特异性,同样的代谢物可通过两种不同顺序的反应而合成。由此形成代谢网(metabolic net)。.第三节第三节 初级代谢产物向抗生素初级代谢产物向抗生素或抗生素组成部分的转化或抗生素组成部分的转化 n一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径n二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径n三、与辅酶代谢有关的生物合成途径三、与辅酶代谢有关的生物合成途径.一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径n一些抗
12、生素,或一些大分子抗生素的组成部分,来源于氨基酸合成代谢或分解代谢的中间产物。.氯霉素的生物合成对氨基苯丙酮酸对氨基苯丙酮酸 转氨基转氨基 氧化氧化 还原还原羟基化羟基化n由分离阻断变株全部中间产物的方法 酶已被鉴定酶已被鉴定.安莎霉素和丝裂霉素C的生物合成中关键的中间物的合成途径n这种产物的一个与众不同的特征,是有一个氨基出现在苯甲酸羧基的间位上(在初级代谢中只有对位或邻位氨基苯甲酸)。312123-H2O-H2O重排重排关键的中间物关键的中间物.林可霉素中脯氨酰部分形成的过程酪氨酸酪氨酸羟基化羟基化 环化环化 氧化氧化,环化环化酰胺化酰胺化 氨基酸分解代谢的例子氨基酸分解代谢的例子.氨基酸
13、的位羟基化n次级代谢的一个典型反应是氨基酸的位羟基化。n对氨基苯丙氨酸的位羟基化是氯霉素生物合成第一阶段反应中的一个反应。n羟化氨基酸作为几种抗生素分子的组成成分而存在;而在糖肽类抗生素及诺卡菌素中的对羟基苯甘氨酸,则是由酪氨酸经过位羟基化所引发的一系列反应生成的。.克拉维酸的生物合成途径 精氨酸精氨酸 环化环化 位羟基化位羟基化环化环化.二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径n具有核苷类结构的抗生素是经过与核苷酸合成有关的途径,或通过常见核苷的修饰作用而生成的。.核苷酸合成的途径n1.从头合成。n2.通过一种称为“补救途径”的方式合成。这种补救途径包括外源嘌呤或
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