电子科大细胞生物学第三章细胞生物学研究方法实用课件.ppt
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- 电子科 细胞生物学 第三 研究 方法 实用 课件
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1、电子科大细胞生物学第三章细胞生物学研究方法 概要了解细胞生物学常用研究方法,概要了解细胞生物学常用研究方法,包括细胞形态结构观察方法、细胞组分分包括细胞形态结构观察方法、细胞组分分析方法、细胞培养方法、细胞工程与显微析方法、细胞培养方法、细胞工程与显微操作技术等。操作技术等。u 细胞形态结构观察方法细胞形态结构观察方法u 细胞组分分析方法细胞组分分析方法u 细胞培养、细胞工程与显微操细胞培养、细胞工程与显微操作技术作技术第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术(light microscopy)肉眼的分辨率:肉眼的分辨率:0.2mm;光镜分
2、辨率:光镜分辨率:0.2um;EM分辨率可达到分辨率可达到0.2nm1m=103mm=106um=109nm原理与应用原理与应用 直接荧光标记技术直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术间接免疫荧光标记技术 应用:在光镜水平用于特异蛋白质等生应用:在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位。物大分子的定性定位。(Fluorescence Microscopy)从细胞群体中分离某些特异染色的细胞;正常二倍体,接触抑制(是指细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象)主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。电融合技术:悬浮细胞在低压交流电场 (100-200V/cm)中聚集成串珠状细胞群
3、或将相互接触的单层培养细胞,加高压脉冲促使融合。物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点,彼此互相共聚焦。单克隆抗体制备中,杂交瘤细胞筛选是关键。但对大多数脂类的固定作用不强,样品仅用戊二醛固定后,其反差不好,最好再用四氧化锇进行后固定。(fluorescence resonance enerrgy transfer,FRET)固定好的样品一般要经过浓度递增的乙醇或丙酮进行脱水。人、鼠杂交细胞中,人的染色体丢失很快。四氧化锇:是一种重金属化合物,能与不饱和脂肪酸反应,是膜结构最佳固定剂。特异蛋白抗原的定位与定性 差速离心:利用不同离心速度分离密度不同的细胞组分。Hela细胞(左)、CHO细胞(右)的培养
4、(Laser Scanning Confocal Microscopy)包括:紫外光显微分光光度测定法动物细胞融合:灭活病毒(如仙台病毒)如:将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注射入培养细胞中,可以看到肌动蛋白分子组装成肌动蛋白纤维。可以从小孢子(雄性生殖细胞)直接发育成胚状体,然后长成单倍体植株;细胞工程使用的主要技术有:如如:将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注射入培养细胞中,可以看到肌动蛋白射入培养细胞中,可以看到肌动蛋白分子组装成肌动蛋白纤维。分子组装成肌动蛋白纤维。将可产生荧光的绿色荧光蛋白(将可产生荧光的绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Pr
5、otein,GFP)基因与某基因与某种蛋白基因融合,在表达这种融合蛋种蛋白基因融合,在表达这种融合蛋白的细胞中,便可直接观察到该蛋白白的细胞中,便可直接观察到该蛋白的动态变化。的动态变化。物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点,彼此互相共物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点,彼此互相共聚焦。激光束(光源)经双色镜反射后,通过物聚焦。激光束(光源)经双色镜反射后,通过物镜汇聚到样品某一焦点。从焦点发射的荧光(样镜汇聚到样品某一焦点。从焦点发射的荧光(样品一般经免疫荧光标品一般经免疫荧光标记)经透镜汇聚成像,记)经透镜汇聚成像,被检测器检出。通过被检测器检出。通过样品其他部位的激光样品其他部位的激光即激光发出的
6、荧光不即激光发出的荧光不会聚焦成像,因而检会聚焦成像,因而检测器不能检出。测器不能检出。排除焦平面以外光的干扰,增强图像反排除焦平面以外光的干扰,增强图像反差和提高分辨率差和提高分辨率(1.41.7倍倍),可重构,可重构样品的三维结构。样品的三维结构。(fluorescence resonance enerrgy transfer,FRET)用于检测活细胞中两个蛋白质分子之间用于检测活细胞中两个蛋白质分子之间的直接相互作用。的直接相互作用。供体发射的荧光与受体发色团分子的吸供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠,且两个探针距离在收光谱重叠,且两个探针距离在10nm范围以范围以内时,会发生
7、一种非放射性的能量转移,产内时,会发生一种非放射性的能量转移,产生生FRET现象。现象。可选择供体蛋白可选择供体蛋白CFP和受体蛋白和受体蛋白YFP分分别与两种目的蛋白融合表达。当这两个融合别与两种目的蛋白融合表达。当这两个融合蛋白之间的距离在蛋白之间的距离在5-10nm的范围内,供体的范围内,供体CFP发出的荧光可被发出的荧光可被YFP所吸收,并激发所吸收,并激发YFP发出黄色荧光。此时可通过测量发出黄色荧光。此时可通过测量CFP荧荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近,作用。两个蛋白距离越近,CFP所发出的荧所发出的荧光被光被Y
8、FP接收的量就越多,检测器所接收到接收的量就越多,检测器所接收到的荧光越少。反之,不会产生的荧光越少。反之,不会产生FRET效应。效应。(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)该技术起源于该技术起源于20世纪世纪70年代。使用与蛋年代。使用与蛋白质或脂质耦联的亲脂性或亲水性的荧光分白质或脂质耦联的亲脂性或亲水性的荧光分子,如荧光素、绿色荧光蛋白等,检测活体子,如荧光素、绿色荧光蛋白等,检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。结构上分子动态变化率的大小。高能量激光束照
9、射使特定区域,该高能量激光束照射使特定区域,该区域荧光会发生不可逆淬灭。光漂区域荧光会发生不可逆淬灭。光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区的白区荧光的恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动荧光标记分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。至光漂白区来完成。原理:原理:是研究膜蛋白或膜脂流动性的基本实验是研究膜蛋白或膜脂流动性的基本实验技术之一。技术之一。荧光素标记膜蛋白或膜脂,然后用激光荧光素标记膜蛋白或膜脂,然后用激光束照射细胞表面某一区域,使被照射区的荧束照射细胞表面某一区域,使被照射区的荧光淬灭变暗。由于膜的流动性,淬灭区域的光淬灭变暗。由于膜的流动性,淬灭区域的亮度逐渐增加,最后
10、恢复到与周围的荧光强亮度逐渐增加,最后恢复到与周围的荧光强度相等。度相等。根据荧光恢复的速度可推算出膜蛋根据荧光恢复的速度可推算出膜蛋白或膜脂扩散速度。白或膜脂扩散速度。抗鼠细胞膜蛋白的荧光抗体(显绿色荧抗鼠细胞膜蛋白的荧光抗体(显绿色荧光)和抗人红细胞蛋白的荧光抗体(显红色光)和抗人红细胞蛋白的荧光抗体(显红色荧光)分别标记小鼠和人的细胞表面,然后荧光)分别标记小鼠和人的细胞表面,然后用灭活的仙台病毒处理使两种细胞融合。用灭活的仙台病毒处理使两种细胞融合。10min后不同颜色的荧光在融合细胞表面开后不同颜色的荧光在融合细胞表面开始扩散,始扩散,40min后已分辨不出融合细胞表面后已分辨不出融
11、合细胞表面绿色荧光或红色荧光区域。绿色荧光或红色荧光区域。证明膜蛋白的流动性证明膜蛋白的流动性 透射电镜(透射电镜(TEM)1)超薄切片技术超薄切片技术2)负染色技术负染色技术3)冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术4)真空喷镀技术真空喷镀技术5)电镜三维重构技术电镜三维重构技术 扫描电镜扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)透射电镜的基本构造透射电镜的基本构造 透射电镜主要制样技术透射电镜主要制样技术1、透射电镜、透射电镜(TEM)显微镜显微镜分辨本领分辨本领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理LM200nm可见光可见光玻璃透镜玻璃透镜不要求真空不要求真空利用样
12、品对光的吸利用样品对光的吸收形成明暗反差和收形成明暗反差和颜色变化颜色变化100nm紫外光紫外光玻璃透镜玻璃透镜不要求真空不要求真空TEM0.1nm电子束电子束电磁透镜电磁透镜要求真空要求真空(1.33x10-51.33x10-3Pa)利用样品对电子的利用样品对电子的散射和透射形成明散射和透射形成明暗反差暗反差Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens.CO 2临界点干燥法防止单一固定剂不能固定细胞内所有组分,常需联合使用不同固定剂。高能量激光束照射使特定区域,该区域荧光会发生不可逆淬灭。(Laser Scanning
13、Confocal Microscopy)此时可通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。4、荧光共振能量转移技术细胞扁平状,排列较规则,贴壁后呈三角形及不规则扁平多角形,中央有偏圆形核,生长时彼此紧密连接成单层细胞,相互拥挤呈现“铺路石块状”,局部可形成单层上皮“膜片组织”。原理是利用schiff试剂与醛基之间的反应,但其醛基来自碘酸氧化多糖的1、2-乙二醇基。大鼠骨髓干细胞的超薄切片 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量;细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry)用于透射电镜(TEM)观察样本内部超微结构。纳米生物学研究领域中的重要
14、工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。(2)原生质体培养(二倍体体细胞培养):(2)原生质体培养(二倍体体细胞培养):可见光显微分光光度测定法3、激光共焦扫描显微镜技术超薄切片一般收集在金属载网上进行观察。免疫小鼠获得小鼠脾细胞(B淋巴细胞)。固定好的样品一般要经过浓度递增的乙醇或丙酮进行脱水。电子束穿透力很弱,很难通过细胞、组织切片,电子束穿透力很弱,很难通过细胞、组织切片,样品须先制备超薄切片。样品须先制备超薄切片。超薄切片厚度:超薄切片厚度:4050nm 制备程序:制备程序:取材取材 固定固定 脱水脱水 浸透浸透 包埋包埋 切片切片 染色染色 观察观察用于透射电镜(用于透射电镜(TEM)
15、观观察样本内部超微结构。察样本内部超微结构。戊二醛:是一种化学交联剂,渗透速率较四氧化锇快,戊二醛:是一种化学交联剂,渗透速率较四氧化锇快,能固定蛋白和糖类(特别是糖原)。一般用能固定蛋白和糖类(特别是糖原)。一般用戊二醛进行前固定。但对大多数脂类的固定戊二醛进行前固定。但对大多数脂类的固定作用不强,样品仅用戊二醛固定后,其反差作用不强,样品仅用戊二醛固定后,其反差不好,最好再用四氧化锇进行后固定。不好,最好再用四氧化锇进行后固定。常用的固定剂:醛类固定剂、四氧化锇等常用的固定剂:醛类固定剂、四氧化锇等单一固定剂不能固定细胞内所有组分,常单一固定剂不能固定细胞内所有组分,常需联合使用不同固定剂
16、。常采用戊二醛和需联合使用不同固定剂。常采用戊二醛和四氧化锇双重固定。四氧化锇双重固定。四氧化锇:是一种重金属化合物,能与不饱和脂肪酸反四氧化锇:是一种重金属化合物,能与不饱和脂肪酸反应,是膜结构最佳固定剂。四氧化锇在随后应,是膜结构最佳固定剂。四氧化锇在随后的脱水过程中可被还原形成锇黑,使样品反的脱水过程中可被还原形成锇黑,使样品反差增强。但四氧化锇渗透缓慢,对酶活性和差增强。但四氧化锇渗透缓慢,对酶活性和抗原活性破坏较大。抗原活性破坏较大。取材与固定取材与固定固定好的样品一般要经过浓度递增的乙醇或固定好的样品一般要经过浓度递增的乙醇或丙酮进行脱水。丙酮进行脱水。脱水后将样品包埋在树脂中,使
17、之获得一定脱水后将样品包埋在树脂中,使之获得一定的硬度、弹性和韧度,这样才易于切成超薄的硬度、弹性和韧度,这样才易于切成超薄切片,并使切片能承受电子束轰击。切片,并使切片能承受电子束轰击。环氧树脂:国产环氧树脂:国产618618环氧树脂、环氧树脂、Epon812等等脱水脱水包埋包埋常用的包埋剂为环氧树脂和丙烯酸树脂等常用的包埋剂为环氧树脂和丙烯酸树脂等丙烯酸树脂:有丙烯酸树脂:有LR White、LR Gold、Lowi-crvls等等超薄切片一般收集在金属载网上进行超薄切片一般收集在金属载网上进行观察。常用铜网为观察。常用铜网为200200400400目,此外目,此外根据不同的实验要求还可选
18、用金网、根据不同的实验要求还可选用金网、镍网等。镍网等。载网上一般包被一层支持膜,以支撑载网上一般包被一层支持膜,以支撑载网上的超薄切片,增加其稳定性。载网上的超薄切片,增加其稳定性。最常用的支持膜是最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲聚乙烯甲醛醛)、火棉胶、碳等。、火棉胶、碳等。包埋好的组织块需在超薄切片机上用包埋好的组织块需在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀切成超薄切片。玻璃刀或钻石刀切成超薄切片。切片切片生物样品多数是由碳、氢、氧、氮等元素组生物样品多数是由碳、氢、氧、氮等元素组成的,这些元素的原子序数低,散射电子的成的,这些元素的原子序数低,散射电子的能力不强,在电镜下的反差非常弱,因
19、此通能力不强,在电镜下的反差非常弱,因此通常需用高分子量的金属盐来对超薄切片进行常需用高分子量的金属盐来对超薄切片进行染色,由于细胞的不同结构对金属盐的亲和染色,由于细胞的不同结构对金属盐的亲和力不同,因此染色后不同结构对电子的散射力不同,因此染色后不同结构对电子的散射能力亦不同,从而增强了细胞结构的反差。能力亦不同,从而增强了细胞结构的反差。常用染色液常用染色液:醋酸双氧铀和铅染液醋酸双氧铀和铅染液电镜观察电镜观察染色与观察染色与观察大鼠骨髓干细胞的超薄切片大鼠骨髓干细胞的超薄切片(引自(引自G.M.Wright et al)细胞工程使用的主要技术有:四氧化锇在随后的脱水过程中可被还原形成锇
20、黑,使样品反差增强。电融合技术:悬浮细胞在低压交流电场 (100-200V/cm)中聚集成串珠状细胞群或将相互接触的单层培养细胞,加高压脉冲促使融合。流式细胞仪(Flow Cytometry)(fluorescence resonance enerrgy transfer,FRET)7nm,可用于观察核孔复合体等更精细结构。最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲醛)、火棉胶、碳等。单克隆抗体(monoclone antibody)技术细胞长梭形,核圆位中央,胞质常外伸2-3个长短突起,多数细胞排列疏散,有较大细胞间隙,有时也相互平行排列,成群细胞呈放射状、旋涡状等形式。超薄切片一般收集在金属
21、载网上进行观察。利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化在病毒大量复制与装配的宿主细胞中,核仁(Nu)依然存在,并保持其转录功能环氧树脂:国产618环氧树脂、Epon812等将肌体取出的细胞或组织进行实效培养。人、鼠杂交细胞中,人的染色体丢失很快。细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry)7倍),可重构样品的三维结构。近年来研制的低压高分辨扫描电镜其分辨率可达0.电镜水平的原位杂交技术(生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合)PAS反应可确定多糖存在。染色背景,衬托出样品的精细结构。染色背景,衬托出样品的精细结构。Examples of negtively
22、stained and metal-shadowed specimens.Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a)or shadow casting with chromium(b).常用染色剂:常用染色剂:2磷磷钨酸水溶液钨酸水溶液(Negative staining)家蚕细小病毒负染色电镜照片家蚕细小病毒负染色电镜照片(病毒直径病毒直径20nm)(陈立华、翟中和)陈立华、翟中和)制备过程简单,只需将样品制成悬液,制备过程简单
23、,只需将样品制成悬液,直接滴于载网上,然后用重金属物质染直接滴于载网上,然后用重金属物质染液染色。即可在液染色。即可在EMEM下观察。下观察。重金属物质散射电子的能力较样品本身重金属物质散射电子的能力较样品本身强,电镜下两者显示出明显的明暗对比,强,电镜下两者显示出明显的明暗对比,样品呈亮色,而其周围的背景将呈暗色,样品呈亮色,而其周围的背景将呈暗色,这样样品表面的微细结构就被衬托出来。这样样品表面的微细结构就被衬托出来。常用染色剂:常用染色剂:2 2磷钨酸水溶液磷钨酸水溶液 真空喷镀一般在喷镀仪中进行,将铂、铬、金真空喷镀一般在喷镀仪中进行,将铂、铬、金等重金属在高真空条件下加热,使其蒸发,
24、蒸等重金属在高真空条件下加热,使其蒸发,蒸发出来的金属粒子以一定的角度斜向喷镀于样发出来的金属粒子以一定的角度斜向喷镀于样品表面,这样凸出的样品表面将比周围背景优品表面,这样凸出的样品表面将比周围背景优先包被一层金属薄膜,二者之间的反差加大,先包被一层金属薄膜,二者之间的反差加大,样品轮廓清晰地显示出来。样品轮廓清晰地显示出来。单方向喷镀,样品向着金属发射源一面沉积金单方向喷镀,样品向着金属发射源一面沉积金属粒子较多,而背侧面较少,形成投影。增强属粒子较多,而背侧面较少,形成投影。增强样品反差,样品富立体感。样品反差,样品富立体感。旋转喷镀,可使样品表面的金属薄膜均匀一致。旋转喷镀,可使样品表
25、面的金属薄膜均匀一致。a a)快速冷冻快速冷冻b b)低温断裂低温断裂c c)蚀刻蚀刻d d)复型复型主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。表面结构。样品在低温下迅速样品在低温下迅速冷冻(液氮或液氦冷冻(液氮或液氦中)和低温下,结中)和低温下,结构构“脆弱脆弱”部位部位(膜脂双分子层疏(膜脂双分子层疏水端)断裂,显示水端)断裂,显示出膜脂中的蛋白质出膜脂中的蛋白质颗粒,真空中冰升颗粒,真空中冰升华,进一步增强华,进一步增强“浮雕浮雕”式蚀刻效式蚀刻效果,铂金喷镀形成果,铂金喷镀形成凹凸电子反差,真凹凸电子反差,真空喷镀碳膜,样品空喷镀碳膜,样品再经消
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