分子生药学课件.ppt
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- 分子 生药 课件
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1、生药学这个学科的建立已经有近生药学这个学科的建立已经有近200年的历史,其间虽然也在年的历史,其间虽然也在不断的发展,然而对生药材鉴定技术而言,最初只是药材性不断的发展,然而对生药材鉴定技术而言,最初只是药材性状鉴别,也就是说药材的状鉴别,也就是说药材的外部形态特征、色泽、断面、质地、外部形态特征、色泽、断面、质地、气味气味等进行药材真伪鉴别,其后逐步发展为药材等进行药材真伪鉴别,其后逐步发展为药材细胞组织形细胞组织形态态特征为依据,其间还在真伪鉴别和质量研究中将理化方法特征为依据,其间还在真伪鉴别和质量研究中将理化方法引入,特别是以引入,特别是以成分分析成分分析为依据,将各种为依据,将各种光
2、谱分析法光谱分析法应用得应用得淋漓尽致,使生药学发展到一个新的高峰。淋漓尽致,使生药学发展到一个新的高峰。分子生药学分子生药学生物分析技术生物分析技术1PPT课件 在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学,在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学,所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法,是生药所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法,是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。学的一个极富前瞻性和前景性的分支。可以说,分子生药学不仅继承传统生药学的内容和使命,更可以说,分子生药学不仅继承传统生药学的内容和使命,更将赋予生药学新的任务和挑战。将赋予生药学新的任务和挑战。分子
3、生药学分子生药学生物分析技术生物分析技术中国中医研究院中药研究所所长中国中医研究院中药研究所所长黄璐琦黄璐琦2PPT课件生药学中的一个分支学科生药学中的一个分支学科中药高产、优质、多抗性品种的培育中药高产、优质、多抗性品种的培育濒危紧缺中药资源的保护和持续利用濒危紧缺中药资源的保护和持续利用中药新的、便捷、准确的分子标识鉴定方法的研究中药新的、便捷、准确的分子标识鉴定方法的研究从基因层次从基因层次,为过去不能很好解决的问题如道地药材的研究、药材品为过去不能很好解决的问题如道地药材的研究、药材品质的定向调控等提供了新的方法和思路。质的定向调控等提供了新的方法和思路。3PPT课件分子生药学研究重点
4、分子生药学研究重点药用植物的分子系统学研究药用植物的分子系统学研究药用植物种质资源的分子生物学研究药用植物种质资源的分子生物学研究生药的分子鉴定研究生药的分子鉴定研究道地药材形成的分子机理研究道地药材形成的分子机理研究珍稀濒危中药资源的遗传多样性分析和保护策略研究珍稀濒危中药资源的遗传多样性分析和保护策略研究药用植物的抗性基因工程研究药用植物的抗性基因工程研究药用化学成分的生物转化及分子机理研究药用化学成分的生物转化及分子机理研究药用植物有效成分生物合成分子机理与调控的研究和药用植物细胞药用植物有效成分生物合成分子机理与调控的研究和药用植物细胞组织和转基因器官培养与活性成分生产等组织和转基因器
5、官培养与活性成分生产等4PPT课件分子生药学研究策略分子生药学研究策略分子遗传标记技术分子遗传标记技术通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律的技术。任何生物种或个体都具有特定的外在性状表现规律的技术。任何生物种或个体都具有特定的DNA 多态性,通过直接诊断分析多态性,通过直接诊断分析DNA 的多态性,便能避开遗传特性表的多态性,便能避开遗传特性表现过程中的环境因素、数量性状遗传或部分与完全显性的干扰,快现过程中的环境因素、数量性状遗传或部分与完全显性的干扰,快速准确地鉴定药材真伪。速准确地鉴定药材真伪
6、。5PPT课件DNA 分子遗传标记技术已有分子遗传标记技术已有20多种,认为五大类比较合适进行研究。多种,认为五大类比较合适进行研究。分子分子生药学生药学研究方法研究方法1.以以Southern 杂交为基础的杂交为基础的DNA分子标记技术分子标记技术2.以以PCR为基础的分子标记技术为基础的分子标记技术3.以重复序列为基础的分子标记技术以重复序列为基础的分子标记技术4.DNA序列分析序列分析6PPT课件DNA 分子遗传标记技术的优点分子遗传标记技术的优点1.DNA 分子标记不受发育时期和环境的影响,分子标记不受发育时期和环境的影响,DNA分子标记分子标记在基因水平进行标记,不受取材部位、时间和
7、环境的影响,在基因水平进行标记,不受取材部位、时间和环境的影响,而形态标记和生化标记都是基因表达的结果,其结果受发而形态标记和生化标记都是基因表达的结果,其结果受发育和环境的影响,测定有时会不准确;育和环境的影响,测定有时会不准确;2.DNA 分子标记通常是共显性,表现的信息量大,可精确鉴分子标记通常是共显性,表现的信息量大,可精确鉴定基因型组合;定基因型组合;3.DNA 分子标记多态性强,根据测得的大量标记位点绘制的分子标记多态性强,根据测得的大量标记位点绘制的连锁图,其多态信息量比形态标记高得多。连锁图,其多态信息量比形态标记高得多。7PPT课件利用利用DNA分子遗传标记和基因组序列分析技
8、术,从居群、分子乃分子遗传标记和基因组序列分析技术,从居群、分子乃至基因水平上,准确刻划药用动植物遗传背景差异和亲缘关系,进而至基因水平上,准确刻划药用动植物遗传背景差异和亲缘关系,进而构建基于叶绿体基因组和(或)和基因组基因序列分析的重要药用动构建基于叶绿体基因组和(或)和基因组基因序列分析的重要药用动植物系统发育树,将是分子生药学基础研究的重心。植物系统发育树,将是分子生药学基础研究的重心。目前可用于分子系统学研究的主要基因种类有:目前可用于分子系统学研究的主要基因种类有:rbcL,matK,rps4,trnT-trnF,ITS等等。以叶绿体基因组片段为主,核基因应等等。以叶绿体基因组片段
9、为主,核基因应用较少但信息量巨大。用较少但信息量巨大。生药的分子鉴定研究生药的分子鉴定研究8PPT课件高纯度的高纯度的DNA模板的制备模板的制备严格的严格的Taq DNA聚合酶浓度和来源聚合酶浓度和来源合适的镁离子浓度,太高会产生弥散背景,太低了合适的镁离子浓度,太高会产生弥散背景,太低了得到的得到的PCR产物条带淡产物条带淡9PPT课件DNA复制原理的具体应用复制原理的具体应用 PCR技术技术Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应聚合酶链反应 它是一种模拟天然它是一种模拟天然DNA复制过程,在有复制过程,在有DNA模板、模板、DNA聚合酶(聚合酶(Taq酶)、酶)、
10、RNA引物和四种引物和四种dNTP的情况下,通过高温变性(的情况下,通过高温变性(9095,12min),低温低温退火(退火(2537,12min),中温延伸(中温延伸(6075,90 sec-5min),这样反复这样反复循环的过程中,在体外扩增特异性循环的过程中,在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。(片段的分子生物学技术。(原理图原理图)1、PCR反应成分:反应成分:Taq DNA聚合酶聚合酶 引物浓度:一般引物浓度:一般0.1-0.5mol/L dNTP:一般为一般为50200mol/L Mg2+模板:模板:PCR对模板的要求不高,单、双链对模板的要求不高,单、双链DNA均可,但均
11、可,但 样品中不能混有蛋白酶、核酸酶、样品中不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以聚合酶抑制剂以 及能与及能与 DNA结合的蛋白质。结合的蛋白质。添加剂:添加剂:DMSO(二甲基亚枫),提高扩增效率及特异性(二甲基亚枫),提高扩增效率及特异性 10PPT课件 (1)理论上理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍,应按合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍,应按2n-2n的指数方式递增,的指数方式递增,PCR反应反应30轮循环后,轮循环后,PCR扩增应达到扩增应达到230个拷贝,约个拷贝,约109个拷个拷贝。但由于贝。但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反应系统的条件等各
12、种因素聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反应系统的条件等各种因素的影响,实际扩增效率比预期的要低,一般可达的影响,实际扩增效率比预期的要低,一般可达106107个拷贝。个拷贝。“平台效应平台效应”:PCR反应中,当引物模板与反应中,当引物模板与DNA聚合酶达到一定比值时,聚合酶达到一定比值时,DNA聚合酶催化反应趋于饱和,即聚合酶催化反应趋于饱和,即PCR反应不再增加。反应不再增加。平台效应在平台效应在PCR反应中是不可避免的,但一般在平台效应出现前,反应中是不可避免的,但一般在平台效应出现前,PCR产物产物的数量足以满足实验的需要。的数量足以满足实验的需要。(2)PCR反应条件的优化反应条件的
13、优化 PCR方法操作简便,但影响因素颇多,因此需要根据不同的方法操作简便,但影响因素颇多,因此需要根据不同的DNA模板,摸索模板,摸索最适条件。主要从:最适条件。主要从:反应的特异性、敏感性、忠实性、扩增效率等四个方面衡量反应的特异性、敏感性、忠实性、扩增效率等四个方面衡量PCR反应的结果。反应的结果。循环参数循环参数 变性变性 退火退火 延伸延伸 PCR反应成分反应成分11PPT课件(3)PCR反应引物的设计反应引物的设计 引物的设计在整个引物的设计在整个PCR扩增中占有十分重要的地位扩增中占有十分重要的地位 特异性,扩增性特异性,扩增性 引物的序列应位于基因组引物的序列应位于基因组DNA的
14、高度保守区,且与非扩增区无同源序列。这样的高度保守区,且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合,提高反应的特异性可以减少引物与基因组的非特异性结合,提高反应的特异性引物长度:引物长度:1530nt为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。引物的碱基尽可能随机发布,避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列,引物的碱基尽可能随机发布,避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列,G+C碱基碱基的含量在的含量在4060之间。之间。引物内部应避免形成二级结构,特别是引物的末端应避免有回文结构。引物内部应避免形成二级结构,特别是引物的末端应避免有回文结构。
15、二个引物不应有互补序列,特别是二个引物不应有互补序列,特别是3端应避免互补,以免形成端应避免互补,以免形成“引物二聚引物二聚 体体”,浪费引物。,浪费引物。引物引物5末端碱基无严格限制,在与模板末端碱基无严格限制,在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下,其结合的引物长度足够的条件下,其5端碱基可不与模板端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态,因此可在引物互补而呈游离状态,因此可在引物5端加上限制性内端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等,引物的产物的分析克隆等,引物的5端端最多可加最多可加10个碱基而对个碱基而对PCR
16、反应无影响。反应无影响。12PPT课件PCR产物的分子克隆产物的分子克隆 克隆克隆PCR产物的目的通常是:建立用于杂交分析的克隆化产物的目的通常是:建立用于杂交分析的克隆化DNA的永久来源,的永久来源,得到高质量的得到高质量的DNA序列结果,以及当序列结果,以及当PCR扩增产生复杂混合产物时用于分离扩增产生复杂混合产物时用于分离PCR目的片段。目的片段。PCR产物的直接克隆可以通过对扩增片段进行合适的末端处理而产物的直接克隆可以通过对扩增片段进行合适的末端处理而提高效率。提高效率。基本方案基本方案 产生产生TA突出端突出端 TaqDNA聚合酶往往在所有的双链聚合酶往往在所有的双链DNA 3末端
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