07第七章酶的抑制作用及抑制课件.ppt

1、失活作用:通过变性作用引起酶活力下降或丧失抑制作用:改变必需基团性质,引起酶活力下降,丧失第一节第一节抑制作用的类型:一、分类:(一)不可逆抑制作用:抑制剂以很牢固的共价键与酶结合，不能用物理方法除去，抑制后酶活力不能恢复 专一性的不可逆抑制剂:非专一性的不可逆抑制剂:(二)可逆抑制作用:抑制剂以非共价键与酶结合阻遏酶的活性，可以用物理方法除去抑制剂后，酶活力能恢复二、区别方法二、区别方法(一一)物理方法物理方法:(二二)动力学方法动力学方法:1.酶预先用抑制剂处理后酶预先用抑制剂处理后测定酶活力变化情况测定酶活力变化情况:2.在测活系统中加入抑制剂在测活系统中加入抑制剂,然后加入不同酶量然后

2、加入不同酶量,测定酶测定酶活力变化情况活力变化情况:第二节不可逆抑制作用第二节不可逆抑制作用一一.非专一性的不可逆抑制作用非专一性的不可逆抑制作用:1.概念概念:2.非专一性的不可逆抑制剂非专一性的不可逆抑制剂 酰化试剂酰化试剂:(酸酐酸酐,乙酰咪唑乙酰咪唑,硫代三氟乙酸乙酯硫代三氟乙酸乙酯,O-甲基甲基异脲异脲)-NH2 NHCO-RR-CO-X +E-OH E-O CO-R +HX -C6H5-OH C6H5-OCO-R -SH SCO-R 烷化试剂:(2.4-二硝基苯氟,碘代乙酸,碘代乙酰胺等)-NH3 -NH-R -SH -S-R R-X +E -COOH E-COOR +HX -S-

3、CH3 -S (CH3)-R 咪唑基NH -咪唑基N-R 含有活泼双键试剂:(N-乙基顺丁烯二酸抱亚胺(NEMI)、丙烯腈等亲电试剂:(四硝基甲烷(TNM)氧化剂:H2O2,NBS等 作用-SH、Trp、吲哚基等还原剂:ME,DTT等,作用-S-S-、OON-CH2-CH3+ENH2SHNHSOON-CH2-CH3OON-CH2-CH3CNO2NO2NO2O2N+OHE-NO2OHE-+CH(NO2)3二、专一性不可逆抑制剂:（一）Ks型不可逆抑制剂:1.概念2.抑制机理E+I EI EIn判断Ks型抑制剂作用是否发生在活性部位方法:化学定量法.底物、竞争性抑制剂保护方法酶先可逆失活,再研究K

4、S型抑制情况亲和标记法图解E IEIEin（二）Kcat型不可逆抑制动力学概念:自杀性底物例如中E.coli中-羟基葵酰硫酯脱水酶CH3-(CH2)6-CH2-CH(OH)-CO-S-R R=-CH2-CH2-NH-CO-CH3 CH3-(CH2)6-CH=CH-CO-S-R (-反式双键)CH3(CH2)5-CH=CH-CH2-CO-S-R (,顺式双键)Kcat型抑制剂:3.4-葵炔酰-N-乙酰半胱胺CH3-(CH2)5-CC-CH2-CO-S-R ECH3-(CH2)5 HC=C=CH-CO-SR CH3(CH2)5HC=C-CH2-CO-SR 不可逆共价结合NHNENN第三节 可逆抑制

5、作用的动力学:可逆抑制作用:Reversible Inhibition1.概念2.类型:竞争性抑制:Comp.C Competitive inhibition 非竞争性抑制 NonC.NC Non-Competitive 反竞争性抑制 UnC.UC Un-Competitive 混合型抑制 MT Mixed Type inhibition一、竞争性抑制作用动力学模型图:竞争性抑制作用动力学方程推导：酶形式 矢量图 动力学项 E k-1k-3+k-3k2 ES k1k-3S EI k-1k3I+k2k3IE +SESE +PI+EIk2k1k-1k3k-3E ESk2k1Sk-1EIk3Ik-3

6、S)I 1(S I)(S)(SE I)(S)(SEESE1213312102021313213312t200ImmKKVkkkkkkkkkvkkkkkkkkkkkkv动力学模型:动力学方程：式中Vm=k2Eo 不变 Km 为米氏常数 Kmapp 表观米氏常数，增大 KI 为抑制常数E +SESE +PI+EIKIk2Km)1(SKIKSVvImmKKIKmappmI()1KkkI 33双倒数作图法：抑制常数：KI的求法：以Kmapp 对I作图，横轴截距为-KI 抑制率i%=(1-vi/vo)100%i%与S有关,S i%-2.0-1.00.01.02.03.04.01/S (mM )24681

7、01214 1/v (OD/min)-1-101234 1111VKVIKSVmmIm()KKIKKKKImappmImmI()10.00.30.60.91.2I (mM)0.00.51.01.52.0Km%100)/1(IKSKImI二、非竞争性抑制作用动力学二、非竞争性抑制作用动力学:动力学模型动力学模型:动力学方程：Vm=k2Eo Vmapp为表观最大速度，减小 Km 为米氏常数，不变。KI 为抑制常数E +SESE +PII+EIESI+SKIKIk2vVSKSKIKIKSVSKSIKmmmIImmI ()()1VSKSm a p pmVVIKm appmI()1双倒数作图法：抑制常数

8、：KI的求法：以1/Vmapp 对I作图，横轴截距为-KI抑制率:i%与S无关,)I1(11)I1(1IIKVSKVKvmmm0.00.51.01.52.0Salicylic Acid(mM)0.01.02.03.04.01/V0.00.40.81.2Kmm-3.0-2.0-1.00.01.02.03.04.05.01/S(mM)2468101/v(U/min)-1-101234)I1(11IKVVmappmiVV oIKII%()1100%100%三、反竞争性抑制作用动力学三、反竞争性抑制作用动力学:动力学模型动力学模型:动力学方程：Vmapp为表观最大速度，减小 Kmapp 为表观米氏常数

9、，减小 KI 为抑制常数E +SESE +PI+ESIKIk2vVSKIKSVSKSmmIm a p pm a p p(1VVIKm a p pmI1KKIKm a p pmI1双倒数作图法：抑制常数：KI的求法：以1/Vmapp 对I作图，横轴截距为-KI抑制率:i%与S有关,S i%1111vKVSVIKmmmI()0.01.02.03.04.05.01/S(mM)24681012141/v(U/min)01234-1-1 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25p-Cumic acid mM0.01.02.03.04.05.06.07.08.0Intercept0.01

10、.02.03.0slopeab)I1(11IKVVmappmioovvooo()1100()IkKSIm21四、混合型抑制作用动力学四、混合型抑制作用动力学:动力学模型动力学模型:动力学方程：Vmapp为表观最大速度，减小 Kmapp 为表观米氏常数，当KI KIS Km减小E +SESE +PII+EIESI+SKIKISk2)I 1()I 1(ISIKSKKSVvmm)1()1()1(ISImappISmappmappmappKIKIKmKKIVmVSKSVv双倒数作图法：抑制常数：KI、KIS的求法：以斜率对I作图，横轴截距为KI以1/Vmapp 对I作图，横轴截距为-KIS11111v

11、KVIKSVIKmmImI()()-2.0-1.00.01.02.03.04.01/S(mM )2468101/v(OD/min)12345-1-1 0.00.51.0 -Toluic acid(mM)0.01.02.03.0Slope 0.00.51.0 -Toluic acid(mM)0.01.02.03.0Interceptoo)I1(IKVKslopemm)I1(11ISKVVInterceptmappm E +SESE +PII+EIESI+SKIKISk2竞争性抑制:Comp.C.Competitive inhibition 非竞争性抑制 NonC.NC.Non-Competiti

12、ve 反竞争性抑制 UnC.UC.Un-Competitive 混合型抑制 MT Mixed Type inhibitionC:KIS UC:KI NC:KI =KISMT:KI =KIS 竞争性抑制剂：C:KIS )I1()I1(ISIKSKKSVvmm)1(SKIKSVvImm-2.0-1.00.01.02.03.04.01/S (mM )2468101214 1/v (OD/min)-1-101234 1111VKVIKSVmmIm()KKIKKKKImappmImmI()10.00.30.60.91.2I (mM)0.00.51.01.52.0Km mmappVVvVSKSKIKIKS

13、VSKSIKmmmIImmI()()1VSKSm a p pmVVIKm a p pmI()1非竞争性：NC:KI =KIS)I 1(11)I 1(1IIKVSKVKvmmm0.00.51.01.52.0Salicylic Acid(mM)0.01.02.03.04.01/V0.00.40.81.2Kmm-3.0-2.0-1.00.01.02.03.04.05.01/S(mM)2468101/v(U/min)-1-101234)I1(11IKVVmappmmmappKK反竞争性 UC:KI )1(SKSVSKIKSVvmappmappImmVVIKm a p pmI10.01.02.03.04

14、.05.01/S(mM)24681012141/v(U/min)01234-1-1 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25p-Cumic acid mM0.01.02.03.04.05.06.07.08.0Intercept0.01.02.03.0slopeab)I1(11IKVVmappmImmappKIKK1-2.0-1.00.01.02.03.04.01/S(mM )2468101/v(OD/min)12345-1-1 )I 1()I 1(ISIKSKKSVvmm)1()1()1(ISImappISmappmappmappKIKIKmKKIVmVSKSVv11111vKVIKSVIKmmImI()()0.00.51.0 -Toluic acid(mM)0.01.02.03.0Slope 0.00.51.0 -Toluic acid(mM)0.01.02.03.0Interceptoo)I1(IKVKslopemm混合型抑制剂：MT:KI =KIS)I1(11IKVVmappm纵轴截距：斜率：1相交2nd相像；1相交3rd相像