荧光偏振免疫分析课件.ppt

1、荧光偏振免疫分析-by-by沈未沈未 荧光偏振荧光偏振(fluorescence polarization,FP)(fluorescence polarization,FP)通常定义通常定义为为:用垂直方向用垂直方向(丄丄)的偏振光激发荧光分子的偏振光激发荧光分子,然后测量发然后测量发射偏振光在垂直方向射偏振光在垂直方向(丄丄)和水平方向和水平方向(丨丨)的荧光光强度的荧光光强度(丨丨)早期的荧光偏振研究均以早期的荧光偏振研究均以P P表示表示,目前其仍常用于临床化目前其仍常用于临床化学和药物筛选学和药物筛选;而而A A多生物学检测多生物学检测,是因其便于进行数据是因其便于进行数据分析和解释某

2、些相关的物理学参数。分析和解释某些相关的物理学参数。FP值是一个比值,一般以mP表示(1P=1000mP)。分子固定不动,即完全偏振时,FP值是P0=1000 mP,是理论上的最大值;在一个分子可以自由运动的系统中,根据分子运动速度的快慢,荧光偏振值大约在0 500 mP之间.论文的结构和主要内容 如果待测样本中竞争抗原含量很少(低于检测限),荧光标记抗原与抗体结合,FP值较高(一般在150-300 mP)。而待测样本中竞争抗原的浓度增加时,荧光标记抗原以游离的形式存在于样本中,FP值便会下降,一般在30-60 mP即为完全抑制 FPIA是均相的竞争免疫分析方法,反应完全在溶液系统中,不需要分

3、离结合的和未结合的抗体。实验操作过程非常简单,仅仅是将抗体,荧光标记的抗原和抗原加入到反应杯中,经过几分钟甚至是几秒钟的温育便可直接测量,很快得到被测抗原的浓度。组蛋白对DNA荧光偏振度影响 1.制备DNA-组蛋白复合体:-DNA(48kbp)用荧光染料YOYO-1标记,碱基对与染料分子之比为10:1;用 Bis-Tris缓冲液(50mmol/L,pH6.6)稀释组蛋白溶液;组蛋白浓度是DNA的10500倍;DNA/YOYO-1溶液(6.5 pmol/L)和稀释后的组蛋白溶液共同保温(37)培育3h,反应液体积为2mL;组蛋白对DNA荧光偏振度影响 2.荧光偏振度测量:用MOS-450/CD测

4、量,其是一个标准的荧光偏振度测量模式;在测量荧光偏振度时,偏振光弹性调制器自动设置在半波长模式,这样激发光在水平分量和垂直分量之间以100 kHz 的频率转换;应用Bio-Kine 软件(Bio-Logic)通过两个散射信号实时计算荧光强度和荧光偏振度;组蛋白对DNA荧光偏振度影响 3.DNA-组蛋白复合体荧光偏振度随组蛋白与DNA 浓度比变化关系曲线组蛋白对DNA荧光偏振度影响 4.对图表的解释:在溶液中单独存在时,DNA分子随机卷曲且有弹性此构型对应着一定的偏振度值.在我们的实验条件下,DNA 分子的荧光偏振度在0.11左右;在组蛋白的作用下，DNA分子发生了凝聚;DNA-组蛋白分子可能呈

5、现更紧密、更小的构型,导致复合体分子比 DNA 分子旋转更快,对应较小的荧光偏振度值;荧光偏振研究的一般步骤 1.确定最佳的荧光标记物;2.确定公式中的各种参数;3.倍比稀释结合物，根据不同的FP值确定最优稀释比，使其结合能力与FP值成线性关系;4.建立标准曲线;5.分析结果,验证实验猜想。荧光偏振免疫分析的优点 1.均相系统,不需要洗涤操作,可大大减少试剂的用量。2.检测速度很快,且易于自动化,适于快速的筛选检测。3.荧光标记抗原的均一性好,性质稳定,可长期保存,方法的重现性好。4.FP值是一个比值,与其他荧光检测技术相比,不易受溶液颜色和仪器灵敏度变化的影响，实验结果稳定,可靠性高。5.选

6、用不同发射波长的荧光素来进行多标记检测,可实现多目标物的同时定性及定量分析。如四甲基罗丹明,其激发和发射光谱与荧光素的重叠很少,因此相互之间基本不会干扰,现已在多标记检测中得到应用。荧光偏振免疫分析的缺点 1.FPIA比ELISA方法的灵敏度低。一般来说FPIA的检测限为0.1-10ng/mL-1左右。2.FPIA易受样本基质(如与基质蛋白的非特异性结合),背景荧光和光散射的影响。3.FPIA的检测信号的背景较高,检测范围(窗口)较窄,信噪比(S/N)较低。4.FPIA对荧光标记物的纯度要求较高,需耍较复杂的纯化步骤。5.FPIA检测需要特定的分析仪器,或对普通的荧光分光光度计增加测量偏振附件。因此价格较普通酶标仪昂贵。对本实验室研究的思考 当研究对象为与核酸(DNA/RNA)互作的蛋白时，可以在核酸的末端加上一个荧光标签,研究二者之间的结合关系,包括结合常数,动力学参数等等。u 推而广之，还通过核推而广之，还通过核酸等小分子研究蛋白酸等小分子研究蛋白-蛋白复合物之间的蛋白复合物之间的结合。结合。