免疫自动化仪器分析课件.ppt

1、免疫自动化免疫自动化仪器分析仪器分析 医学检验系 刘利东概论早期免疫分析通过观察沉淀物形成，凝集及溶血现象发生来分析，如免疫扩散、免疫电泳、血凝试验、补体结合等上世纪50年代末60年代初，利用AG-AB复合物形成使浊度改变，再用比浊计来比浊，但因其敏感性差未被接受70年代初，开始有自动检测系统，但因其用的是激光为光源，固定波长，灵敏度较低，而且时间一般要23小时概论v70年代未，速率比浊计的出现，使抗原抗体结合的反应在几十秒内出结果，可以说是免疫化学测定的革命的发展v随着标记技术的发展，免疫化学可以纳入临床化学检验范畴v如今，自动化免疫分析系统更加飞速发展v自动化免疫分析的基础是抗原抗体的结合

2、，具有高特异性；手段多是利用标记技术而将检测信号放大，具有高灵敏度自动化免疫仪器种类（应用技术）v免疫比浊分析技术v化学发光、电发光分析技术v荧光免疫分析技术v放射免疫分析技术v酶免疫分析技术v流式细胞术免疫比浊v利用抗原抗体结合后溶液的浊度变化而检测的一种方法v此法准确快速，已成为免疫诊断技术中重要的检测手段v比浊法与比色法散射免疫比浊分析法 基本原理：抗原抗体复合物对一定波长的光产生折射、偏转，偏转角度及散射光强度与复合物粒子的大小和量有关（图）Rayleigh散射（图）Mile散射Heidelberger曲线定时散射比浊分析v基本原理：免疫沉淀反应和散射比浊分析结合之技术，反应分两个阶段

3、，预反应阶段和反应阶段（图）v保证抗原不过量的方法：确保反应体系抗体过量 对抗原过量进行阈值限定预反应阶段5ul样本抗原过剩区阈值信号反 应 阶 段45ul样本7.5秒2分钟6分钟（2+4分钟）定时散射比浊反应曲线图定时散射比浊反应曲线图抗原不过量抗原过量速率散射比浊分析v基本原理：抗原抗体结合反应的一种动态测定法，适时检测抗原抗体复合物形成的散射光信号v最快反应时间（图）v抗原过量检测（图）抗原浓度递增抗原浓度递增散射光峰值散射光峰值峰值信号与抗原抗体反应之间的关系图峰值信号与抗原抗体反应之间的关系图ABCDFGHI反应时间（秒）06085散射率抗体过量抗原过量第二峰值信号抗原量检测速率峰值

4、信号产生免疫透射比浊v基本原理：检测信号是通过溶液的光，测量角度与正前方夹角为0（图），保持抗体过量，形成可溶性AG-AB复合物，使介质浊度发生改变。v实验要求：选择亲和力高的抗体，抗原抗体复合物要大、数量要多，反应时间充分。单色器透射比浊计散射散射比浊计比浊计散射比浊和透射比浊的区别示意图透射光透射光散射光散射光散射光散射光胶乳浊度测定法v基本原理是：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比（图）光

5、波光波胶乳浊度测定法原理dd 2d影响免疫比浊的因素 v抗原抗体比例v抗体纯度和效价v增聚剂（PEG）自动免疫浊度分析仪的要求v校准程序，使仪器处于正常的工作状态v定标程序，保证检测结果的准确性v自动控制，保证实施实验条件中的抗原抗体反应体系要求v自动系统，障碍的检测和预警。自动化免疫仪器种类（应用技术）v免疫比浊分析技术v化学发光、电发光分析技术化学发光、电发光分析技术v荧光免疫分析技术v放射免疫分析技术v酶免疫分析技术v流式细胞术化学发光自动免疫分析v化学发光是指在化学反应过程中产生光的发射现象v基本原理：标记在抗原或抗体上的发光物质在碱性介质中氧化时产生激发态的中间体，中间体回基态时产生

6、辐射，多余的能量为发射光子，产生发光现象，再对光信号进行接收转化，可得检测物浓度v发光物质须具备：氧化致发光、光量子产额高、理化性能好化学发光自动免疫分析类型v 化学发光免疫分析（CLIA）是一种用发光剂直接标记抗体的一类免疫分析法，用来标记的发光物必须能参与发光反应、标记和偶联后能稳定、理化性质和免疫特性不改变，多用吖啶酯类和苯酚类化合物。化学发光自动免疫分析类型v化学发光酶免疫分析（CLEIA）以催化反应的酶为标记物，抗原抗体结合后，其中的酶可对发光体系产生催化作用，产生发光效应。发光信号与抗原抗体的量成正比。多用的发光体系是HRP-鲁米诺。化学发光自动免疫分析类型v微粒子化学发光免疫分析

7、（ECIA）也是一种酶免疫分析，用磁珠作为固相载体，增加反应体积和分离效率。标记的酶多为ALP。化学发光自动免疫分析类型v电化学发光免疫分析（ECLIA）一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程,其中应用了“亲和素-生物素”放大系统，使检测的灵敏度大大提高v以双抗体夹心法为例之图示（图）ECLIA体系结构图体系结构图ECLIA检测流程图一检测流程图一（双抗体夹心的形成）（双抗体夹心的形成）ECLIA检测流程图二检测流程图二 （生物素与亲和素结合）（生物素与亲和素结合）ECLIA检测流程图三检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）（磁珠吸引吸附于电极表

8、面）ECLIA检测流程图四检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）（电极充电启动电化学反应）ECLIA检测流程图五检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）（撤消磁场冲洗磁珠）化学发光自动免疫分析v化学发光免疫分析是免疫技术、发光技术和计算机系统的结合，具有特异性强、灵敏度高（pg/ml)、精密度好、准确度好等特点，越来越多的人体微量指标应用这种方法来检测，已渐渐代替了RIA。自动化免疫仪器种类（应用技术）v免疫比浊分析技术v化学发光、电发光分析技术v荧光免疫分析技术荧光免疫分析技术v放射免疫分析技术v酶免疫分析技术v流式细胞术荧光免疫自动化v利用荧光物质标记抗原抗体的一种检测方法v由免疫反应、荧光及

9、计算机技术联合应用的技术v主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定荧光免疫自动化v时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）：AG-AB结合，某些荧光物质发长寿命荧光，时间分辨技术v利用长寿命荧光物质（镧氏元素铕螯合物）标记抗原或抗体，测定过程中，可利用延迟时间来消除非特异性的荧光干扰（图）。光强度激发短寿命荧光长寿命荧光延迟时间测量时间铕螯合物的激发、发射光谱荧光免疫自动化vTRFIA设计中的一些注意事项：Stakes位移（图）解离增强荧光免疫自动化v荧光偏振免疫测定：以小分子物质与大分子物质的旋转差异而使它们对偏振光的吸收不同为依据检测小分子药物v荧光酶免疫分析：标记酶参与反应波长300 40

10、0 500 600 700Stakes吸光度Stakes位移示意图激发光激发光荧光荧光自动化免疫仪器种类（应用技术）v免疫比浊分析技术v化学发光、电发光分析技术v荧光免疫分析技术v放射免疫分析技术v酶免疫分析技术v流式细胞术流式细胞术流式细胞仪v流式细胞仪（流式细胞仪（FCM）是以激光为光源，检测）是以激光为光源，检测生物学颗粒理化性质的仪器生物学颗粒理化性质的仪器v生物学颗粒包括免疫复合物、生物学颗粒包括免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细胞、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细胞、染色体、真核细胞等染色体、真核细胞等v理化性质则为细胞大小、形状、胞浆颗粒、理化性

11、质则为细胞大小、形状、胞浆颗粒、DNA含量、酶活性等含量、酶活性等流式细胞仪vFCM综合了激光技术、电子技术、流体力学、综合了激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学及计算机技术，被称为实验室细胞化学及计算机技术，被称为实验室“CT”vFCM现正广泛应用于细胞生物学、免疫学、现正广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、病理学、遗传学、临床检肿瘤学、血液学、病理学、遗传学、临床检验学等验学等流式细胞仪基本原理v基本原理：单个经荧光染料染色的细胞经过激光激发后，发射的荧光在不同的角度进行测量，并对其信号进行综合分析（图）v细胞分选原理：通过测量区的细胞若其参数符合实验设计的条件，在经过偏转板时

12、被充上相应的电荷并被偏转收集（图）v液流系统：样本和鞘流液组成（图）v光学系统：光源可为汞灯或激光激光v信号接收系统：散射光和荧光的检测流式细胞仪基本组成侧向荧光信号鞘流前向散射光流式细胞流动池示意图喷嘴激光束散射光的检测v信号的产生及强度（图）v前向散射光（图）v侧向散射光（图）信号的产生激光照射区信号检测曲线细胞中荧光素今量与信号的关系信号的产生细胞中荧光素今量与信号的关系信号的产生激光器激光器激光探测器大颗粒小颗粒前散射光示意图激光器激光器侧向散射光探测器复杂颗粒简单颗粒侧向散射光示意图荧光测量v荧光染料染色的细胞通过测量区时，细胞中特异性荧光物质受激发产生荧光信号，后者强弱表示待测物质

13、的多少v荧光的检测系统由滤光片和检测器组成，滤光片的作用是使激发光波长尽可能接近荧光染料的激发光谱峰值，滤除非荧光信号，提高荧光的检测强度流式细胞仪免疫分析的技术要求v仪器性能指标：荧光分辨率、荧光灵敏度、前向角散色光灵敏度、前向角散光分辨率、分析/分选速度、分选纯度、分选收获率v检测样品要求要单细胞悬液v荧光标记常用的染料有异硫氰基荧光素、藻红蛋白类v全程质量控制流式细胞仪的临床应用v细胞生物学：周期分析v免疫学：与单克隆抗体结合应用，在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监督、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性等方面都起着相当重要的作用v肿瘤学：基因水平的分析，为肿瘤的诊断、治疗及预后评价提供重要的信息v血液学：分析正常细胞与肿瘤细胞THE END