酵母双杂交系统技术介绍课件.ppt

1、主要内容主要内容 酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的背景介绍 酵母双杂交的基本原理酵母双杂交的基本原理 ClontechClontech 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 常见问题分析常见问题分析背景介绍背景介绍:关注蛋白质关注蛋白质蛋白质蛋白质相互作相互作用研究用研究蛋白组时蛋白组时代代蛋白质功蛋白质功能能生物信息生物信息学的发展学的发展背景介绍背景介绍:为什么要研究蛋白互作？为什么要研究蛋白互作？发现新的蛋白质和蛋白质的新功能发现新的蛋白质和蛋白质的新功能在细胞体内研究抗原和抗体的相互作在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用用筛选药物的作用位点筛选药物的作用位点研究药物对蛋白质之间相互作用的影研究药

2、物对蛋白质之间相互作用的影响响建立基因组蛋白连锁图建立基因组蛋白连锁图背景介绍背景介绍:Clontech:Clontech 酵母双杂交系统的功酵母双杂交系统的功能能发现新的与已知蛋白互作的蛋白发现新的与已知蛋白互作的蛋白鉴定两个蛋白之间的相互作用鉴定两个蛋白之间的相互作用确定蛋白相互作用的区域确定蛋白相互作用的区域背景介绍背景介绍:Clontech:Clontech分子生物学工具分子生物学工具ClontechMatchmakerMatchmakerGeneGeneFunctionFunctionGeneGeneExpressionExpressionGeneGenediscoverydisco

3、very背景介绍背景介绍:Matchmaker Gold:Matchmaker Gold 系统系统 Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System System（630491630491）酵母单杂交酵母单杂交-蛋白与蛋白与DNADNA的相互作用的相互作用 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid SystemMatchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System（63048963

4、0489）Make your own“Mate&Make your own“Mate&Plate”libraryPlate”library System(630490)System(630490)酵母双杂交酵母双杂交-蛋白与蛋白的相互作用蛋白与蛋白的相互作用 pBridgepBridge Three-Hybrid Vector Three-Hybrid Vector（630404630404）酵母三杂交酵母三杂交三个蛋白之间的相互作用三个蛋白之间的相互作用背景介绍背景介绍:Matchmaker:Matchmaker GoldGold系统原理系统原理Reporter GeneReporter G

5、eneReporter Gene主要内容主要内容 酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的背景介绍 酵母双杂交的基本原理酵母双杂交的基本原理 ClontechClontech 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 常见问题分析常见问题分析基本原理基本原理:酵母双杂交参考文献酵母双杂交参考文献 NatureNature.1989 Jul 20;340(6230):245-6.1989 Jul 20;340(6230):245-6.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.A novel genetic system to dete

6、ct protein-protein interactions.Fields SFields S,Song OSong O.Department of Microbiology,State University of New York at Stony Department of Microbiology,State University of New York at Stony Brook,Stony Brook 11794.Brook,Stony Brook 11794.63000次引用基本原理基本原理:GAL4:GAL4转录因子的结构转录因子的结构ADADDNA-BDDNA-BDGAL4

7、 GAL4 蛋白具有两个功能结构域蛋白具有两个功能结构域BDBD结合结构域结合结构域ADAD激活结构域激活结构域基本原理基本原理:GAL4:GAL4转录因子的分子机理转录因子的分子机理在在GAL4 basedGAL4 based双杂交系统中双杂交系统中:正常情况在酵母细胞内正常情况在酵母细胞内:Promotergal metabolic geneGAL UASTranscriptionADBDReporter GeneGAL4 AD基本原理基本原理:三个启动子，四个报告基因三个启动子，四个报告基因报告基因表达报告基因表达AbAAbA抗性筛选抗性筛选AdeAde营养筛选营养筛选HisHis营养筛

8、选营养筛选X-a-galX-a-gal蓝白筛选蓝白筛选M1G1G2主要内容主要内容 酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的背景介绍 酵母双杂交的基本原理酵母双杂交的基本原理 ClontechClontech酵母双杂交系统酵母双杂交系统 常见问题分析常见问题分析Clontech MMClontech MM系统的优点系统的优点设计设计巧妙巧妙抗性抗性筛选筛选异常异常简便简便SMARTSMART方法与同源重组同源重组技术结合构建文库，聪明的酵母自己做克隆。AbAAbA抗性筛选的添加，有效抑制背景生长，大大降低假阳性。文库构建于型酵母菌株型Y187中，方便后续与a型菌株Y2H Gold进行matingmat

9、ing直接筛选。Clontech MMClontech MM系统系统:蛋白互作基本流程蛋白互作基本流程验证蛋白互作验证蛋白互作自己构建文库：自己构建文库：630490630490预制细菌文库：预制细菌文库：638802638802（传统型）（传统型）预制酵母菌文库：预制酵母菌文库：630480630480（均一化，通用型）（均一化，通用型）ClontechClontech蛋白互作相关试剂盒蛋白互作相关试剂盒文库筛选文库筛选文库构建文库构建酵母双杂交系统：酵母双杂交系统：630489630489酵母菌转化试剂盒：酵母菌转化试剂盒：630439630439酵母培养基（套装）：酵母培养基（套装）：6

10、30495630495插入片段检测：插入片段检测：630497630497酵母质粒提取：酵母质粒提取：630467630467体内验证：体内验证：630489630489630305630305体外体外Co-IPCo-IP验证：验证：630458630458630459630459631723631723631604631604文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech MM文库构建方法文库构建方法 SMART SMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml matingAAAAA

11、AAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGLD-PCRLD-PCRCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTGGG SMART SMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml mating自己自己做克隆做克隆文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech

12、MM文库构建方法文库构建方法 SMART SMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml mating文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech MM文库构建方法文库构建方法文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech MM自制文库筛选自制文库筛选 SMART SMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml mating文库筛选文库筛选:Clontech MM:Clont

13、ech MM文库筛选文库筛选630489 630489 Matchmaker Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid SystemGold Yeast Two-Hybrid System630489630489Y187Y187Y2H GoldY2H Gold三个载体三个载体阳性对照，阳性对照，阴性对照。阴性对照。BD vectorBD vector：pGBKT7pGBKT7AD vector:pGADT7AD vector:pGADT7630439630439极大提高转化率极大提高转化率可以单独购买可以单独购买文库筛选文库筛选:Clontech MM:Clontech

14、 MM 系统质粒系统质粒诱饵载体诱饵载体In Y2H GoldIn Y2H Gold文库载体文库载体In Y187In Y187文库筛选文库筛选:诱饵载体构建及其自激活检测诱饵载体构建及其自激活检测SD-Trp/X/A文库筛选文库筛选:Mating:Mating方法筛选方法筛选Y187Y187 型型DDODDO筛选筛选二倍体二倍体Y2H GoldY2H Golda a 型型Mating Mating 接合反应接合反应 酵母的有性生殖过程，酵母的有性生殖过程，ClontechClontech利用这个过程，实现了文库筛选。利用这个过程，实现了文库筛选。MixMixMatingMatingQDOQD

15、O筛选筛选文库筛选文库筛选:均一化通用文库筛选均一化通用文库筛选均一化通用型文库均一化通用型文库高丰度与低丰度均衡高丰度与低丰度均衡大大降低工作量大大降低工作量大大降低假阳性大大降低假阳性更高的基因代表性更高的基因代表性NormalizedUniversalPre.library文库筛选文库筛选:传统细菌文库筛选传统细菌文库筛选文库培养文库培养提取质粒提取质粒转化酵母菌转化酵母菌 取1ml菌液按照一定比例用LB稀释，150ul/板进行涂板，过夜培养。将提取的质粒转化Y187，获得酵母文库。MatingMating筛选筛选将文库与诱饵培养液混合，进行Mating。涂筛选板，挑取阳性克隆子。刮取平

16、板上的菌落，提取质粒。文库筛选文库筛选:验证阳性克隆子（验证阳性克隆子（PCRPCR确认）确认）25ul 2mix30 PCR30 PCRcyclescycles25ul H2O630497 630497 Matchmaker Matchmaker Insert Check PCR Mix2Insert Check PCR Mix2文库筛选文库筛选:酵母质粒提取酵母质粒提取630467 630467 E Easy yeast Plasmid Isolation Kit asy yeast Plasmid Isolation Kit 验证互作验证互作:体内验证体内验证SEAPSEAP630305

17、 630305 Mammalian Mammalian Matchmaker Two-Matchmaker Two-Hybrid Assay Kit 2Hybrid Assay Kit 2验证互作验证互作:体外体外Co-IPCo-IP验证验证BaitAcGFP1AcGFP1PLPLPreyPreyProtein A/GAgarose beadsMatchmaker Chemiluminescent Co-IP Vector SetMatchmaker Chemiluminescent Co-IP Vector Set（630458630458）Matchmaker Chemiluminesce

18、nt Co-IP KitMatchmaker Chemiluminescent Co-IP Kit（630459630459）Prolabel Chemiluminescent Detection Kit Prolabel Chemiluminescent Detection Kit（631723631723）验证互作验证互作:体外体外Co-IPCo-IP验证实验流程验证实验流程PLPL检测检测验证互作验证互作:FRET:FRET分析分析632466 632466 pDsRedpDsRed-Monomer-C1 Vector-Monomer-C1 Vector632470 632470 pAc

19、GFP1pAcGFP1-C1-Vector-C1-VectorClontech MatchmakerClontech Matchmaker系统产品选择指南系统产品选择指南1.1.The FRIGIDA Complex Activates Transcription of FLC,a Strong Flowering Repressor in Arabidopsis,by Recruiting The FRIGIDA Complex Activates Transcription of FLC,a Strong Flowering Repressor in Arabidopsis,by Recr

20、uiting Chromatin Modification FactorsChromatin Modification Factors K Choi,J Kim,HJ Hwang,S Kim-The Plant Cell,2011-Am Soc Plant Biol 2.2.Extracellular signal-regulated kinase 8(Erk8)controls estrogen-related receptor Extracellular signal-regulated kinase 8(Erk8)controls estrogen-related receptor (E

21、RRERR)cellular localization and inhibits cellular localization and inhibits its transcriptional activityits transcriptional activity M Rossi,D Colecchia,C Iavarone,A Strambi-Journal of Biological,2011 ASBMB3.3.WSB-1,a novel IL-21 receptor binding molecule,enhances the maturation of IL-21 receptorWSB

22、-1,a novel IL-21 receptor binding molecule,enhances the maturation of IL-21 receptor H Nara,T Onoda,M Rahman,A Araki-Cellular,2011 Elsevier4.4.FHL1 interacts with oestrogen receptors and regulates breast cancer cell growthFHL1 interacts with oestrogen receptors and regulates breast cancer cell growt

23、h L Ding,C Niu,Y Zheng,Z Xiong-Journal of Cellular,2011-Wiley Online Library5.5.Rab4 interacts with the human Pglycoprotein and modulates its surface expression in multidrug resistant K562Rab4 interacts with the human Pglycoprotein and modulates its surface expression in multidrug resistant K562 cel

24、ls cells C FerrndizHuertas-Journal of Cancer,2011-Wiley Online Library6.Duplicated C-class MADS-box genes reveal distinct roles in gynostemium development in Cymbidium ensifolium 6.Duplicated C-class MADS-box genes reveal distinct roles in gynostemium development in Cymbidium ensifolium(Orchidaceae)

25、(Orchidaceae)SY Wang,PF Lee,YI Lee,YY Hsiao-Plant and Cell,2011-Jpn Soc Plant Physiol7.7.Protein Interaction Domain Mapping of Human Kinetochore Protein Blinkin Reveals a Consensus Motif for Binding of Protein Interaction Domain Mapping of Human Kinetochore Protein Blinkin Reveals a Consensus Motif

26、for Binding of Spindle Assembly Checkpoint Proteins Bub1 and BubR1Spindle Assembly Checkpoint Proteins Bub1 and BubR1 T Kiyomitsu,H Murakami-Molecular and Cellular,2011-Am Soc Microbiol Clontech MatchmakerClontech Matchmaker系统近期参考文献系统近期参考文献主要内容主要内容 酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的背景介绍 酵母双杂交的基本原理酵母双杂交的基本原理 ClontechC

27、lontech 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 常见问题分析常见问题分析常见问题分析常见问题分析:酵母双杂交文库如何获得？酵母双杂交文库如何获得？购买购买ClontechClontech公司公司预制文库预制文库用用630490630490自己自己构建文库构建文库请请TakaraTakara公司公司提供提供文库构建服务文库构建服务如何获得酵母双杂交文库如何获得酵母双杂交文库常见问题分析常见问题分析:一定要做自激活检测吗？一定要做自激活检测吗？必须滴！自激活检测必须做：自激活检测必须做：1.需要在Y2H GoldY2H Gold菌株中进行。2.如果出现自激活现象需要调整AbAAbA浓度或者调整序列序

28、列。3.如果菌落生长过慢，可能是表达有毒性，需要用低拷贝质粒pGBT9pGBT9(630490提供)。常见问题分析常见问题分析:诱饵的大小有限制吗？诱饵的大小有限制吗？我们有文献报道的我们有文献报道的8-7508-750个氨基酸都有成功的案例。个氨基酸都有成功的案例。1.Heery,D.M.et al.(1997)Nature 387387(6634):733736.2.Schaefer B.C.,Ed.(1997)Gene Cloningand Analysis:Current Innovations,(Horizon Scientific Press),pp 1128.常见问题分析常见问题分析:培养基较软或发黑？培养基较软或发黑？灭菌条件灭菌条件控制控制调整调整pHpH购买购买方便包装方便包装让培养基正常起来让培养基正常起来酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍40401/2/20231/2/2023谢谢观看！2020