实时定量PCR课件.ppt
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- 实时 定量 PCR 课件
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1、1实时定量PCRQuantitative Real-Time PCR梁沛中国农业大学昆虫学系2主要内容n基本原理n几个概念n绝对定量n相对定量n常见问题3一、基本原理41993年,日本Higuchi 等人首次采用动态PCR的方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析,首次提出了荧光定量PCR技术的概念。荧光染料:EB(溴乙锭)PCR仪:改良的热循环仪激发光:UV射线检测器:CCD相机缺点:仪器耗费巨大;非特异产物导致定量不准确5n1995年美国PE公司成功开发TaqMan技术n1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等6n实时定量PCR技术
2、(real-time quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入,实时监测整个PCR过程中荧光信号的累积强度,并利用特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。nRT-PCR:Reverse-transcription PCRnqRT-PCR:quantitative Real-time PCR789检测通道n2004年推出的7300和7500均为第三代产品,2001推出的7900为第二代产品。n7300:4通道n7500:5通道n均需加Rox染料进行校正1011两种荧光标记法1.染料染色-SYBR Green I-EB2.探针标记-Taqman-Taqman MGB-分子信标
3、12SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm1.荧光染料法荧光染料法13化学原理14染料法的优缺点:n实验设计简单,仅需要设计一对上下游引物,不需要设计探针,通用性好;n成本低;n可通过分析检验扩增产物的特异性。n低通量实验一般优先考虑使用SYBR Green I染料法。15染料法的优缺点nSYBR Green I方法对PCR扩增特异性要求较高SYBR Green I 可与所有的双链 DNA 相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性nSYBR Green I 不能区分不同扩增片段发出的荧光而导致它不能用于多
4、重反应 162.荧光探针法(Taqman)17Taqman ProbeQuencherReporter18Tagman probe 的工作原理19探针与PCR产物的数量关系n每产生一个新的DNA片段,就切断一条探针n每切断一条探针,就产生一个单位的荧光信号n信号强度与DNA的copy数成正比20探针法的优缺点nTagman探针法中,除引物外,还使用了一条特异的探针,因此此方法可以特异的检测目标序列,防止非特异产物的干扰影响定量的准确性n可用于多重反应,即可同时检测多个目的基因。n但探针设计成本较高,有时探针设计困难。21二、几个概念221.扩增曲线n描述PCR动态进程的曲线称为扩增曲线。nPC
5、R的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线,而是呈S型曲线CyclesFluoresces231.扩增曲线n扩增曲线分三个阶段:扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化。,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,可选择该阶段进行定量分析。扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。242.荧光阈值n一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline,基线期),即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。n是人为设定的一个值,可设在指数扩
6、增阶段任意位置上。n缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍(自动)。2.荧光阈值25262.荧光阈值n手动设置,原则:大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,真正的信号是超过域值的荧光信号。273.Ct值nCycle threshold,就是当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环次数。线性图谱半对数图谱28Ct值的重现性293.Ct值nCt值与模版的拷贝数存在着线性关系,起始拷贝数越多,达到阈值所需的循环数就越少,Ct值也就越小,反之亦然。n正常的Ct值范围在18-30之间,过大和过小都将影响实验数据的精度。3031Ct值定量的数学
7、原理32Ct值定量的数学原理33Ct值定量的数学原理34Ct值定量的数学原理0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRnThreshold10410310235靶标基因的定量36靶标基因的定量50001000012需要制备标准品需制作绝对标准曲线无需标准品,需制作相对标准曲线37靶标基因的定量CYP6B6Actin38三、绝对定量39三、绝对定量40三、绝对定量41三、绝对定量1.化学合成目的基因,是纯度高、定量准确是受化学合成工艺限制,只能合成120bp以下的长度;2.回收纯化PCR产物后克隆到载体上,然后抽提
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