免疫组化及特殊染色概要课件.ppt

1、免疫组织化学技术免疫组织化学技术 Immunohistochemistry Immunohistochemistry techniques techniques 第一节第一节 免疫组织化学免疫组织化学 技术概述技术概述（一）发展简史（一）发展简史 n19411941年年CoonsCoons首先用荧光素标记抗体检测首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。肺组织内的肺炎双球菌获得成功。n6060年代年代NakaneNakane建立酶标抗体技术运用铁建立酶标抗体技术运用铁蛋白标记蛋白标记AbAb技术技术n70 70、80年代多位科学家改良上述技术，年代多位科学家改良上述技术，建立辣根过

2、氧化物酶建立辣根过氧化物酶-抗过氧化物酶抗过氧化物酶（PAPPAP）技术技术,抗生物素抗生物素生物素（生物素（ABC）法法使免疫组织化学进入了应用阶段。使免疫组织化学进入了应用阶段。n20002000年以后各种免疫组化技术更加成熟年以后各种免疫组化技术更加成熟,使免疫组化技术成为当今生物医学中形使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。一。定义定义:是应用是应用免疫学免疫学基本原理基本原理抗原

3、抗原抗体反应，即抗原与抗体抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体标记抗体的显色剂的显色剂(荧光荧光素、酶、金属离子、同位素素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多显色来确定组织细胞内抗原（多肽和肽和蛋白质蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫免疫组织化学技术组织化学技术(immunohistochemistry)或或免疫细胞化学技免疫细胞化学技术术(immunocytochemistry)。将将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记，试剂抗原或试剂抗体用可以微量检

4、测的标记物进行标记，在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。用，进一步提高了免疫技术的敏感性。（二（二）免）免疫组织化学的原理疫组织化学的原理n抗原抗原是指能够刺激是指能够刺激机体机体产生（特异性）产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫免疫效应效应（特异性反应）的物质。抗原的基（特

5、异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性的产物发生反应，也就是抗原性 n病原微生物病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行在医疗中将病原微生物制成疫苗进行预防预防接种接种，可以提高人的，可以提高人的免疫力免疫力。n嗜异性抗原嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人一类与种属特异性无关的、存在于人以及某些以及某些动物动物、植物植物、微生物的性质相同的抗原。、微生物的性质相同的抗原。n肿瘤抗原肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发由物理

6、的、化学的因素或某些病毒诱发的的实验动物实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性抗原，称为抗原，称为肿瘤特异性抗原肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤。已证实在某些人类肿瘤中心存在着与病毒密切相关的抗原。中心存在着与病毒密切相关的抗原。n同种异体抗原同种异体抗原n动物免疫血清动物免疫血清与人类有关的抗原与人类有关的抗原 n抗体抗体（antibody）指机体的免疫系统在）指机体的免疫系统在抗原抗原刺激下，由刺激下，由B淋巴细胞或淋巴细胞或记忆细胞记忆细胞增增殖分化成的殖分化成的浆细胞浆细胞所产生的、可与相应所产生的、可与相应抗原发生抗原发生特异性特异性结合

7、的免疫球蛋白。结合的免疫球蛋白。世界著名抗体公司世界著名抗体公司 nSanta公司、公司、Abcam公司、公司、nAbgent公司、公司、Proteintech Group、Cell Signaling Technology（CST）、）、n罗氏公司（罗氏公司（Roche）它它借助于借助于荧光素、酶荧光素、酶等标记抗体等标记抗体与组织切片或细胞涂片中相关与组织切片或细胞涂片中相关抗原抗原相相结合，由于荧光素所发荧光可用荧光结合，由于荧光素所发荧光可用荧光显微镜检出，而酶可经一定的显色处显微镜检出，而酶可经一定的显色处理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准确定位欲测定的

8、抗原物质。确定位欲测定的抗原物质。标记物标记物荧光素、酶荧光素、酶标记标记抗抗 体体抗抗 原原荧光荧光阳性色彩阳性色彩显微镜观察显微镜观察组织抗原组织抗原抗体抗体 酶酶荧光素荧光素NoImage 三大系统三大系统 本技术是应用免疫学原理本技术是应用免疫学原理来识别待测抗原，再通过酶和底物来识别待测抗原，再通过酶和底物的作用外加显色剂，将上述反应显的作用外加显色剂，将上述反应显示出来。示出来。免疫组免疫组织化学织化学识别系统识别系统联结系统联结系统显示系统显示系统n识别系统识别系统是指特异性抗体识别组织是指特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特异性结合是本

9、技术的基本依异性结合是本技术的基本依据。据。n联结系统联结系统由联结抗体构成。它的作由联结抗体构成。它的作用是联接识别系统和显示系统。用是联接识别系统和显示系统。n显示系统显示系统的目的是使抗原抗体间的的目的是使抗原抗体间的特异性结合变为肉眼可见。因此显特异性结合变为肉眼可见。因此显示系统由示系统由标记酶，底物和显色剂组标记酶，底物和显色剂组成成，以在靶抗原存在位点上形成有，以在靶抗原存在位点上形成有色沉淀。色沉淀。特点特点：特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高定位准确和简便快速等优点定位准确和简便快速等优点又能够将形态、功能及代谢的研又能够将形态、功能及代谢的研究有机结合起来。究有机结合起来。I

10、HC方法方法1 1 过过去用过的方法去用过的方法ABCABC法，法，SPSP法法。三步三步法，使用生物素法，使用生物素2 2 目目前最常用的方法前最常用的方法二步法：二步法：EnliVisionEnliVision显色系统显色系统（即用型非生物素免疫组化（即用型非生物素免疫组化EnliVisionTM plusEnliVisionTM plus检测试剂盒检测试剂盒 ）n将多个抗鼠和抗兔的将多个抗鼠和抗兔的IgGIgG分子二抗与辣根过氧分子二抗与辣根过氧化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大分子多聚体（分子多聚体（polymerpolymer），直接放大

11、信号），直接放大信号40-5040-50倍。倍。n敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。物素干扰）。3 3 最新一代的免疫组化最新一代的免疫组化 NovolinkNovolink Polymer Polymer法：法：使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻碍，比传统中的大分子聚合物染色更显著），碍，比传统中的大分子聚合物染色更显著），信号放大更强，还可以检测到组织中低浓度信号放大更强，还可以检测到组织中低浓度的抗原。的抗原。IHC方法方法 EnliVisionEnliVision法的工作程法的工作程序序

12、：切切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸，片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸，APESAPES）nH H2 2O O2 2处处理（理（阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗n组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化消化暴露出暴露出抗原决定簇），抗原决定簇），TBSTBS漂洗漂洗n内源性过氧化物酶的阻断内源性过氧化物酶的阻断n一抗孵育，一抗孵育，TBSTBS漂洗漂洗n二抗孵育，二抗孵育，TBSTBS漂洗漂洗nDABDAB显色，蒸馏水中止反应显色，蒸馏水中止反应n苏木素复染及封片苏

13、木素复染及封片 IHCIHC技术的基本操作流程技术的基本操作流程切片切片烤片烤片脱蜡水化脱蜡水化H H2 2O O2 2处理处理热修复热修复一抗一抗二抗二抗EnlivisionEnlivision试剂试剂DABDAB显色显色苏木素复染苏木素复染IHCIHC染色结果的判读原则染色结果的判读原则玻片干燥造成的玻片干燥造成的“边缘效应边缘效应”假假阳阳性性未阻止内源性过氧化物酶未阻止内源性过氧化物酶阻止内源性过氧化物酶后阻止内源性过氧化物酶后I.I.注意影响注意影响IHCIHC结果判读的因素结果判读的因素酒精固定酒精固定福尔马林固定福尔马林固定胰腺，胰腺，insulin平滑肌肉瘤，平滑肌肉瘤，SMA

14、气泡影响抗体抗体反应气泡影响抗体抗体反应冰冻切片冰冻切片石蜡切片石蜡切片结肠，结肠，CEA假阴性：注意内对照假阴性：注意内对照假假阴阴性性蛋白酶处理后蛋白酶处理后蛋白酶未处理蛋白酶未处理皮肤，皮肤，IV胶原胶原甲状旁腺，甲状旁腺，PTH微波未处理微波未处理微波处理后微波处理后II.II.染色的特异性判定染色的特异性判定MitochondoriaMitochondoriaApicalApicalmembranemembraneBasolateralBasolateral membranemembranePlasma Plasma MembraneMembrane+PERPER GolgiGolg

15、iPlasma Plasma membranemembranePER+PER+GolgiGolgiGolgiGolgiapparatusapparatusEndocrineEndocrinegranulegranuleEndocrine granuleEndocrine granuleLysosomeLysosomeCytosolCytosolNucleusNucleusCytoskeletoCytoskeleton nl amylaseamylasel lysozomelysozomel PAcPPAcPl S-100 S-100 l NSE NSEl prefixationprefixat

16、ion diffusion diffusion artifact artifactl CEACEAl EMA EMAl ALP ALPlCD10CD10l cytochromecytochrome P-450 P-450l immunogloblinimmunogloblinl AFP AFPl HCG HCGl factor-RA factor-RAl prolactinprolactin in in activated activated pituicytepituicytel SCSCl EGFR EGFRlE-cadE-cadl LeuLeu 4 4l HLA-DR HLA-DRl C

17、EA,EMA,CEA,EMA,SC,CA19-9 SC,CA19-9 in cancer cell in cancer celll LeuLeu 1 1l LCA LCAl PALP in PALP in seminomaseminoma cell celllCerb-B2Cerb-B2l SC,AFPSC,AFP EMA,EMA,immunoglobulin immunoglobulin in special in special conditions conditionsl chromograninchromogranin A Al serotonin serotoninl Peptide

18、 Peptide hormonehormonel DNA polymerase DNA polymerase l S-100(occasional)S-100(occasional)l estrogen receptor estrogen receptorl keratin inkeratin in carcinoidcarcinoid,mesotheliomamesotheliomal vimentinvimentinl keratin inkeratin in adenocarcinomaadenocarcinoma hepatocytehepatocytel actinactinl ke

19、ratinkeratinl vimentinvimentinl GFAP GFAPl tubulintubulin细胞膜阳性细胞膜阳性n细胞粘附分子：细胞粘附分子：E-E-cadherincadherin、CD31CD31、CD56CD56等等n交联膜蛋白分子：交联膜蛋白分子：catenincatenin、dystrophindystrophin 等等n细胞表面受体：细胞表面受体：EGFREGFR、c-erbB2c-erbB2、c-kitc-kit/CD117/CD117（酪氨酸激酶受体）等酪氨酸激酶受体）等n绝大多数白细胞抗原绝大多数白细胞抗原:LCALCA、CD20CD20、CD2CD2、

20、CD5CD5等等n表面或跨膜蛋白：表面或跨膜蛋白：VillinVillin、BerEP4BerEP4、EMAEMA、CEA CEA、CA125CA125、EBV-LMP1EBV-LMP1等等细胞核阳性细胞核阳性n细胞周期素蛋白细胞周期素蛋白：cyclinscyclins、cyclincyclin 依赖激依赖激酶酶(cdkcdk)、cdkcdk 抑制剂抑制剂(如如 p16)p16)等等n细胞增殖相关蛋白细胞增殖相关蛋白：Ki67Ki67、PCNAPCNAn转录因子转录因子：MyoD1MyoD1、myogeninmyogenin、TTF-1TTF-1、CDX2CDX2、PAX5PAX5n肿瘤抑制基

21、因肿瘤抑制基因：如：如 p53p53、p63p63、RbRb、WT1WT1n基因错配产物基因错配产物：如：如 MLH1MLH1、MSH2MSH2n细胞核酶细胞核酶：如 TdTn类固醇激素受体类固醇激素受体：如 ER、PR、ARn细胞核钙结合蛋白细胞核钙结合蛋白：如 S100蛋白、calretininn定位细胞核的病毒定位细胞核的病毒：如 CMV、HBcAg（核+核周）nNeuN：neuronal nuclei，表达于成熟的神经元细胞浆内颗粒状阳性细胞浆内颗粒状阳性-定位于细胞器定位于细胞器n溶酶体颗粒溶酶体颗粒：如 lysozyme、CD68、myeloperoxidasen黑色素小体和前黑色

22、素小体黑色素小体和前黑色素小体：如 HMB45、Melan-An细胞毒颗粒细胞毒颗粒：如TIA-1、granzyme Bn线粒体线粒体:如抗线粒体抗体,HEP-PAR1n神经内分泌颗粒神经内分泌颗粒：各种激素（如PTH、ACTH、insulin）、CgA、SynnW-P W-P 小体小体:F-VIII相关抗原n分泌颗粒分泌颗粒：如BRST-2、surfactant、PSAn细胞内微生物细胞内微生物：如弓形虫细胞浆纤维状阳性细胞浆纤维状阳性-中间丝或微丝中间丝或微丝中间丝中间丝;CK;CK;VimentinVimentin;DesminDesminGFAPGFAP（glialglial fibr

23、illaryfibrillary acidic protein acidic protein，胶质纤维酸性蛋白胶质纤维酸性蛋白 ）NFNF（NeurofilamentNeurofilament，神经元胞浆，神经元胞浆节细胞节细胞神经瘤，副节瘤神经瘤，副节瘤/嗜铬细胞瘤嗜铬细胞瘤，神经母细胞，神经母细胞瘤）瘤）NestinNestin：巢蛋白，神经前体细胞巢蛋白，神经前体细胞弥漫或片状的细胞浆阳性弥漫或片状的细胞浆阳性n蛋白分布在细胞内液、大量的微囊及内质蛋白分布在细胞内液、大量的微囊及内质网中网中n如如:myoglobinmyoglobin、hemoglobinhemoglobin、album

24、inalbumin、AFPAFP、NSENSE、cytoplasmic Igcytoplasmic Ig、CD3CD3n病毒颗粒病毒颗粒/蛋白蛋白n如如:HBsAgHBsAg（常在核旁着色）（常在核旁着色）n从细胞间液吸收的蛋白从细胞间液吸收的蛋白n如如:IgIg、albuminalbumin 分化差恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断；分化差恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断；证实内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤；证实内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤；应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤，如癌应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤，如癌胚抗原（胚抗原（CEACEA）对胃肠道癌、甲胎蛋白（）对胃肠道癌、甲胎蛋白（AFPAFP）对肝癌和卵巢内

25、胚窦癌诊断有帮助；对肝癌和卵巢内胚窦癌诊断有帮助；（三）免疫组化的应用（三）免疫组化的应用 有时可帮助确定肿瘤的良恶性，如应用免有时可帮助确定肿瘤的良恶性，如应用免疫球蛋白轻链疫球蛋白轻链和和来鉴别滤泡性恶性淋来鉴别滤泡性恶性淋巴瘤和滤泡性反应性增生；巴瘤和滤泡性反应性增生；研究某些癌症与病毒的关系，如肝癌与乙研究某些癌症与病毒的关系，如肝癌与乙型肝炎病毒、鼻咽癌与型肝炎病毒、鼻咽癌与EBEB病毒、宫颈癌与病毒、宫颈癌与乳头状瘤病毒等的关系；乳头状瘤病毒等的关系；为肿瘤治疗的选择提供依据，如乳腺为肿瘤治疗的选择提供依据，如乳腺癌检测雌、孕激素受体（癌检测雌、孕激素受体（ERER、PRPR）呈阳

26、）呈阳性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗可预期获得较好的疗效；可预期获得较好的疗效；检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如c-erbB2c-erbB2，p53p53）、增生活性抗原（如）、增生活性抗原（如Ki-67Ki-67，PCNAPCNA）用来估计肿瘤的预后。）用来估计肿瘤的预后。免疫组化在临床诊断中免疫组化在临床诊断中 应用病例示范（应用病例示范（Case 1Case 1）n临床病史资料：临床病史资料：4848岁，男性，胃活检标岁，男性，胃活检标本取自胃大弯部位。本取自胃大弯部位。H&EH&E染色切片描述肿染色切片描述肿瘤细胞显

27、示在间质中呈癌巢样，邻近的瘤细胞显示在间质中呈癌巢样，邻近的腺体肠上皮化生，间质中的不规则的巢腺体肠上皮化生，间质中的不规则的巢状结构待诊断状结构待诊断.nH&E染色 n 首先选择首先选择Cytokeratin单克隆广谱角蛋白抗体在单克隆广谱角蛋白抗体在细胞巢中呈强阳性染色，证明是上皮来源性的细胞巢中呈强阳性染色，证明是上皮来源性的肿瘤，在图片顶部是非肿瘤性的腺上皮阳性，肿瘤，在图片顶部是非肿瘤性的腺上皮阳性，肿瘤性的腺体在底部。肿瘤性的腺体在底部。n 肿瘤细胞再进一步进行肿瘤细胞再进一步进行cytokeratin 7/cytokeratin 20染色，染色证实在肿瘤染色，染色证实在肿瘤细胞中

28、同时缺少细胞中同时缺少cytokeratin 7/cytokeratin 20的表达。在这张图片中肠上皮的表达。在这张图片中肠上皮细胞细胞cytokeratin 20阳性与邻近的肿瘤细胞阴性形成明显的对照。阳性与邻近的肿瘤细胞阴性形成明显的对照。cytokeratin 7 and 20在临床中使用中，如果同时都不表达，特异性地表示在临床中使用中，如果同时都不表达，特异性地表示肿瘤细胞为来源于一些上皮的肿瘤（肿瘤细胞为来源于一些上皮的肿瘤（subset of epithelial tumors），包括肾），包括肾细胞癌，前列腺癌、肝细胞癌和神经内分泌肿瘤等。细胞癌，前列腺癌、肝细胞癌和神经内分泌

29、肿瘤等。SynaptophysiSynaptophysin n 测定测定SynaptophysiSynaptophysin n所有肿瘤细所有肿瘤细胞中都显示出胞中都显示出较强的阳性表较强的阳性表达，而在肿瘤达，而在肿瘤细胞中包绕的细胞中包绕的肠腺体呈阴性肠腺体呈阴性诊断诊断:神经内神经内分泌癌分泌癌 Ki-67 Ki-67 测定测定:Ki-67 Ki-67 在肿瘤细胞呈现非常低的表达，在肿瘤细胞呈现非常低的表达，Ki-67 Ki-67 染色同样证实为肿染色同样证实为肿瘤细胞增殖率低，肠腺上皮中瘤细胞增殖率低，肠腺上皮中Ki-67 Ki-67 高表达，可能是胃小凹腺体，与高细胞增殖高表达，可能是

30、胃小凹腺体，与高细胞增殖率的腺上皮相比率的腺上皮相比Ki-67Ki-67在肿瘤细胞中缺少胞核表达。这些在肿瘤细胞中缺少胞核表达。这些Ki-67 Ki-67 标记阴性的肿瘤标记阴性的肿瘤细胞是低分级的神经内分泌癌细胞，细胞是低分级的神经内分泌癌细胞，第二节第二节 免疫组织化学染色前免疫组织化学染色前的基本技术的基本技术(一一)样样品的取材品的取材 组织标本组织标本包括石蜡切片（病理切片和包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。组织芯片）和冰冻切片。细胞标本细胞标本后者包括组织印片和细胞涂片。后者包括组织印片和细胞涂片。n 其中石蜡切片是制作组织标本最常其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基

31、本的方法，对于组织形态保存用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研对照观察；还能长期存档，供回顾性研究究.样品制备的第一步就是取材，取材的好样品制备的第一步就是取材，取材的好坏关系到实验的结果。所以必须做好准备工坏关系到实验的结果。所以必须做好准备工作。作。现将现将组织取材的原则和具体要求组织取材的原则和具体要求分述如下：分述如下：1 1 刀刀剪锐利、洁净。剪锐利、洁净。2 2 快快速、准确、尽量保持生活状态，速、准确、尽量保持生活状态，力争力争1 1分钟之内放入固定液，最迟不能超分钟之内放入固定液

32、，最迟不能超 过过3 3分钟。分钟。3 3 一一刀切取，切取应在蜡版或滤纸上进刀切取，切取应在蜡版或滤纸上进 行，避免拉锯、牵拉或挤压等动作。行，避免拉锯、牵拉或挤压等动作。4 4 低低温操作，防止自溶现象，通常以温操作，防止自溶现象，通常以 0-40-4的低温条件下操作为佳。的低温条件下操作为佳。5 5、样品大小适当，光镜样品一般在、样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm1.0cm以内，以内，免疫组织化学样品大约在：免疫组织化学样品大约在：2cm2cm1.5cm1.5cm0.3cm0.3cm 厚度控制在厚度控制在0.3cm0.3cm。电镜样品规格要求切成。电镜样品规格要求切成0.5-1.0c

33、m0.5-1.0cm共共3 3小块。小块。对对病理组织病理组织取材还应做到以下几点：取材还应做到以下几点：取材部位必须是主要病变区；取材部位必须是主要病变区；必须取病灶与正常组织的交界区；必须取病灶与正常组织的交界区；必要时取远离病灶的正常组织做对照。必要时取远离病灶的正常组织做对照。细胞标本的取材细胞标本的取材印片法印片法:常用于活检标本常用于活检标本沉淀法沉淀法:主要用于胸水、腹水、尿液等主要用于胸水、腹水、尿液等穿刺抽吸法：常用于淋巴结、软组织、穿刺抽吸法：常用于淋巴结、软组织、肾、肝、肺等组织。肾、肝、肺等组织。注意事项：注意事项：细胞经离心后细胞粘附性较差，标记过细胞经离心后细胞粘附

34、性较差，标记过程中容易脱片，载玻片应涂粘附剂程中容易脱片，载玻片应涂粘附剂细胞总数应以细胞总数应以10105 5个为宜，并集中在直个为宜，并集中在直径径0.6-1.0cm0.6-1.0cm的圆圈内。的圆圈内。富于粘液的标本，未经处理不宜作免疫富于粘液的标本，未经处理不宜作免疫组化标记。组化标记。（二）、组织固定（二）、组织固定 2 2、免疫组化标本固定时，好的固定剂应、免疫组化标本固定时，好的固定剂应 满足哪些要求？满足哪些要求？1 1、目的、目的:固有形态和结构、抗原完整性固有形态和结构、抗原完整性能快速固定抗原；能快速固定抗原；防止抗原物质扩散；防止抗原物质扩散；固定后的抗原能被抗体识别，

35、固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应。不影响抗原抗体反应。甲醛固定液：分类较多，最常用的甲醛固定液：分类较多，最常用的4%4%多多聚甲醛固定液，对于冰冻切片，甲醛固聚甲醛固定液，对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；定有时比冰冻丙酮好；n主要特点：主要特点：组织穿透性好，收缩性小组织穿透性好，收缩性小n但对于不同的组织和抗原，可选用不同但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。意说明书。3 3、各种固定液：、各种固定液：BouinBouin,S S

36、固定液：饱和苦味酸固定液：饱和苦味酸750ml750ml，甲醛甲醛250ml250ml，冰醋酸，冰醋酸50ml50ml，其对组织的，其对组织的穿透力较强穿透力较强，固定较好，结构完整，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。保存。PLPPLP液：即高碘酸钠液：即高碘酸钠-赖氨酸赖氨酸-多聚多聚甲醛，适于固定石蜡切片。甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。抗原性保存较好。（三）、组织脱水浸蜡及包埋（三）

37、、组织脱水浸蜡及包埋脱水透明等过程需在脱水透明等过程需在4 4或室温或室温下进行，避免下进行，避免组织抗原的损失；组织抗原的损失；为使组织充分脱水、透明和浸蜡，组织块的厚为使组织充分脱水、透明和浸蜡，组织块的厚度以度以1.0-1.5mm1.0-1.5mm为宜为宜;浸蜡及包埋过程中浸蜡及包埋过程中,石蜡温度应保持在石蜡温度应保持在6060或或6060以下以下,用熔点低的石蜡包埋用熔点低的石蜡包埋;制备蜡块在较低的温度进行制备蜡块在较低的温度进行,故试剂处理时应故试剂处理时应适当延长适当延长,否则会给切片带来困难否则会给切片带来困难常用的包埋法常用的包埋法石蜡包埋石蜡包埋冰冻干燥包埋冰冻干燥包埋塑

38、料包埋塑料包埋（四）组织切片中载玻片的处理（四）组织切片中载玻片的处理n 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射n等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证n试验的正常进行，可选用试验的正常进行，可选用Poly-L-Lysine Poly-L-Lysine、nZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTMZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTM或或nZLI-9005 ZLI-9005 等几种试剂，对已常规清洗的载等几种试剂，对已常规清洗的载n玻片进行处理。具体方法如下：玻片进行处理

39、。具体方法如下：Poly-L-LysinePoly-L-Lysine：将洗净、干燥的：将洗净、干燥的载玻片放入以载玻片放入以1:101:10比例去离子水稀比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5 5分分钟，钟，6060o oC C烤箱烘烤一小时或室温过烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。器具均为非玻璃制品。（五）抗原修复（五）抗原修复n 抗原修复是指石蜡、冰冻、火抗原修复是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHCIHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、前用胰蛋白酶

40、、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过露或抗原性得到一定程度的恢复过程。程。石蜡切片为什么要做抗原修复？有那些方法石蜡切片为什么要做抗原修复？有那些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽隐蔽.所以要求在进行所以要求在进行IHCIHC染色时染色时,需要先进行需要先进行

41、抗原修复或暴露抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有常用的抗原修复方法有微波修复法，微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热高压加热法，酶消化法，水煮加热法法等，常用的修复液是等，常用的修复液是pH6.0pH6.0的的0.01mol/L0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。的柠檬酸盐缓冲液。抗原修复方法抗原修复方法一、热修复一、热修复 n1 1、微波炉加热法、微波炉加热法 将玻片分别插入抗原修复盒中，以保证各将玻片分别插入抗原修复盒中，以保证各部位的玻片受热均匀。部位的玻片

42、受热均匀。n在抗原修复盒中加入抗原修复液，盖上带有在抗原修复盒中加入抗原修复液，盖上带有小孔的盖子。小孔的盖子。n将塑料盒置于微波炉中央，加热将塑料盒置于微波炉中央，加热 2x5min 2x5min。两次加热之间，加入两次加热之间，加入 50ml 50ml 蒸馏水。蒸馏水。加热加热过程中，组织标本不可干燥。过程中，组织标本不可干燥。第二次处理后，将微波炉中的修复盒移至第二次处理后，将微波炉中的修复盒移至室温冷却室温冷却 15-20 15-20 分钟。分钟。不要打开盖子！不要打开盖子！蒸馏水冲洗。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶并置于蒸馏水中。阻断内源性过氧化物酶并置于蒸馏水中。用用 TBS T

43、BS 或或 PBS PBS 液冲洗。液冲洗。进行免疫组化染色。进行免疫组化染色。在压力锅中放入在压力锅中放入 1500-3000ml 1500-3000ml 抗原修抗原修复缓冲液加热到沸腾，不加阀，玻片插入复缓冲液加热到沸腾，不加阀，玻片插入切片架并放入沸腾的修复缓冲液中。后加切片架并放入沸腾的修复缓冲液中。后加阀，使之加压阀，使之加压2 2分钟。后将压力锅置于流分钟。后将压力锅置于流水槽或继续冷却水槽或继续冷却 20 20 分钟（减压）。取出分钟（减压）。取出切片，蒸馏水冲洗，移至切片，蒸馏水冲洗，移至 TBS TBS 或或 PBS PBS 液液中，以避免组织干燥。中，以避免组织干燥。以下同

44、微波炉修复法以下同微波炉修复法 。2、压力锅法、压力锅法n 抗原修复的方法选择，关系到组织抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当根据不同的效果有很大影响。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如些细胞内抗原（如FasFas、BaxBax、FF等）和等）和细胞间质抗原（如细胞间质抗原（如LamininLaminin、CoIVCoIV等）则等）则需要用酶消化法处理切片。需要用酶消化法处理切片。二、酶消化方法二、酶消化方法n1 1、胰蛋白酶处理：、胰蛋白酶

45、处理：nA A 滴加一滴胰蛋白酶工作液于组织上。滴加一滴胰蛋白酶工作液于组织上。nB B 室温室温 37 37 孵育孵育 20-40 20-40 分钟，孵育时间分钟，孵育时间的长短依福尔马林固定时间及所测抗原情况的长短依福尔马林固定时间及所测抗原情况而定。而定。nC C 蒸馏水冲洗，终止反应。蒸馏水冲洗，终止反应。nD D 阻断内源性过氧化物酶。阻断内源性过氧化物酶。nE E 免疫组化染色。免疫组化染色。n2 2、胃蛋白酶处理、胃蛋白酶处理 nA A 滴加胃蛋白酶工作液于组织上。滴加胃蛋白酶工作液于组织上。nB B 最佳消化时间取决于福尔马林的固定最佳消化时间取决于福尔马林的固定时间，时间，3

46、7 37 预热。一般消化预热。一般消化 10 10 分钟，分钟，长至长至 30 30 分钟。分钟。nC C 以下同胰蛋白酶处理方法以下同胰蛋白酶处理方法 3,4,5 3,4,5。n注：过度消化将导致组织结构的丢失，注：过度消化将导致组织结构的丢失，并引起组织脱片并引起组织脱片三、综合方法三、综合方法 n微波炉加胰酶修复法：微波炉加胰酶修复法：n将组织切片置于盛有将组织切片置于盛有 50ml 50ml 修复液的塑料盒中，封修复液的塑料盒中，封口膜封口后加热口膜封口后加热 5 5 分钟。分钟。n冷却后打开，将切片置于冷却后打开，将切片置于 37 37 预热的蒸馏水中，预热的蒸馏水中，胰蛋白酶消化。

47、胰蛋白酶消化。n室温胰蛋白酶处理室温胰蛋白酶处理 30 30 秒钟。秒钟。n蒸馏水冲洗。蒸馏水冲洗。n阻断内源性过氧化物酶，置蒸馏水中。阻断内源性过氧化物酶，置蒸馏水中。n免疫组化染色。免疫组化染色。操作中还应注意如下问题：操作中还应注意如下问题：n1 1、热处理后应注意自然冷却。、热处理后应注意自然冷却。2 2、热处理时要防止切片干燥。、热处理时要防止切片干燥。3 3、应根据不同的抗体选择合适的抗原修、应根据不同的抗体选择合适的抗原修复方法。复方法。4 4、一批抗原的检测其温度和时间一定保、一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。持一致。n5 5、注意形态学结构的改变、注意形态学结构的改变(

48、一般经高温修复后一般经高温修复后胞浆会无明显的破坏，而对细胞核的影响较大，胞浆会无明显的破坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但核破坏较轻核破坏较轻)。6 6、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTAEDTA等可等可改善某些抗原的修复。改善某些抗原的修复。n操作

49、中应注意以下问题：操作中应注意以下问题：1.1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。2.2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。3.PBS3.PBS洗涤要充分。洗涤要充分。4.4.要设阴性和阳性对照。要设阴性和阳性对照。5.5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。显色注意底物要适量、时间要严格控制。6.6.消除内源性生物素活性：预先以消除内源性生物素活性：预先以0.01%0.01%抗生物素溶抗生物素溶液作用切片液作用切片20min20min。7.ABC7.ABC复合物应在临用前复合物应在临用前3

50、0min30min配置。配置。8.ABC8.ABC试剂保存温度以试剂保存温度以4 4 为佳，保存达数年仍可获为佳，保存达数年仍可获满意效果。满意效果。9.9.抗体保存：抗体保存：-20-20 分装冻存，或于分装冻存，或于4 4 常规使用，常规使用，切忌反复冻融。切忌反复冻融。免疫组化染色方法选择的原则免疫组化染色方法选择的原则 要根据需要证明的抗原的种类、标本中的抗要根据需要证明的抗原的种类、标本中的抗原保存情况、来选择最佳的方法。简单来说，就原保存情况、来选择最佳的方法。简单来说，就是是五个五个“S”S”。首先是首先是“specificity”specificity”，即特异性。，即特异性。