RNA干扰与应用精讲课件.ppt

1、RNARNA干扰干扰 RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链RNA引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。简介简介何为何为RNARNA干扰技术干扰技术 RNA 干扰(RNA Interference,RNAi)是通过体外人工合成的或体内的双链RNA(Dubble-stranded RNA,dsRNA)在细胞内特异性的降解

2、其同源mRNA,使相应的基因沉默,达到阻止基因表达的目的。Glossary(术语术语)RNAi-RNA interference(RNA干扰干扰)siRNAs-Small interfering RNAs(小干扰性小干扰性RNA)dsRNA-double strand RNA(双链双链RNA)RISC-RNA-induced silencing complex(RNA诱导沉默复合物诱导沉默复合物)RdRP-RNA-directed RNA polymerase(RNA指导指导RNA聚合酶聚合酶)Dicer-RNaseIIIrelated enzymes(RNaseIII家族成员家族成员)PTG

3、S-Post-transcriptional gene silencing 转录后基因沉默转录后基因沉默RNAiRNAi发生过程发生过程 RNAi发生的基本过程可分为起始阶段起始阶段和效应阶段效应阶段。在起始阶段在起始阶段,一种称为Dicer的酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或由转基因、病毒感染、转座子的转录产物等各种方式引入的dsRNA，短的dsRNA继而形成有效复合物：RISC、RITS或miRNA。RNase的2个催化中心由2个单体酶组成，其核体以反向平行的排列方式与dsRNA结合形成4个活性中心。中间2个未被活化，使得作用中心有一定的距离，因此Dicer能将dsRNA比较均

4、匀地切成2123nt大小的siRNA(shortsmall interference RNA)。Dicer的结构变化会引起siRNA长度的改变，这使得siRNA具有种族差异。产生的产生的siRNA有有3大特点；长度为大特点；长度为2123nt；末端有；末端有2nt未配对碱基；未配对碱基；5末端磷酸化。末端磷酸化。在效应阶段在效应阶段，siRNA参与形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)。RISC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋，然后利用其内部的单链siRNA，通过碱基配对识别与之互补的靶RNA，随后，RISC中的核酸内切酶在距离

5、siRNA 3端12个碱基的位置切割靶RNA，最后，切割后的靶RNA在核酸外切酶的作用下被降解掉，导致目的基因的沉默。目前研究比较清楚见使用较多的一种基因沉默小分子是siRNA，它分别在两种的水平上引导基因沉默，体现RNAi的作用。(1)转录水平 (2)转录后水平 转录水平 RNA介导的DNA甲基化(RNAdirected DNA methylation，RdDM)被最早发现于类病毒感染的番茄中。dsRNA被降解成2123nt的小片段RNA时，这些小的RNA分子在细胞核可诱发同源序列的DNA甲基化。这种序列特异性的甲基化的信号与RNADNA结合有关。当dsRNA含有与启动子同源的序列，即可使同

6、源靶启动子序列甲基化，从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默。转录后水平首先特异性的Dicer酶依赖ATP切割dsRNA，将其分解成具有2个核昔酸的3末端的小片段的双链siRNA。其次RISC识别并降解mRNA。RISC是一种蛋白RNA效应器核酸酶复合物。双链siRNA为RISC的重要组成部分，它依赖ATP解旋并导致RISC活化，然后通过碱基互补配对识别底物mRNA与之结合，并自siRNA的3端将mRNA切割成小于12nt的片段使其降解。RNARNA干扰干扰所所涉及的技术涉及的技术 一般来说，任何克隆的基因都可能成为寡RNA的靶，不管该RNA是人工设汁的，还是RNA表达的病毒载体，只要其与靶

7、基因转录的mRNA具有序列互补性即可。下面将RNAi主要涉及到的技术作一般的介绍。干扰RNA(siRNA)及合成 RNAi质粒和病毒裁体的构建 转染方法干扰干扰RNA(siRNA)及合成及合成 2023bp的双链siRNA是可以进行大量合成的，而且也很容易进行细胞的转染。在一过程中，首先需要获得目的基因的cDNA序列，然后以cDNA为模板合成siBNA。一般人们选择的区域是以靶基因转录物的AUG起始密码子下游50100bp处开始选择siRNA作用位点，而5和3非编码区和起始密码十附近区域应尽量避免 双链siRNA的设计、合成是进行RNAi研究的关键 siRNA的体外转录可以直接制备双链的siR

8、NA。这一方法所需要的条件是要拥有带噬菌体启动子的线性DNA模板以及相应的用于PCR 扩增所涉及到的试剂，这其中包括噬菌体RNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶。RNA聚合酶是体外转录合成siRNA的关键性酶，常用的RNA聚合酶有T7T3和SP6，它们都以DNA为模板，并要求有特异性的启动子序列。RNA聚合酶与双链的DNA启动子结合后，它将打开双链DNA模板合成互补于DNA的RNA链。当然如果所用的模板是cDNA，可根据cDNA序列相对于启动子的方向设计正义、反义模板，即可合成出对应的正义、反义RNA链，经杂交可得双链RNA。RNAi质粒和病毒裁体的构建质粒和病毒裁体的构建在进行在进行RNAi

9、研究中什么要用到表达质粒和病毒载体呢研究中什么要用到表达质粒和病毒载体呢?其中一个其中一个主要的原因是表达载体可以在细胞中持续产生siRNA以达长久抑制靶mRNA的目的。另外另外的原因是特定的病毒载体对特定的细胞非常有效，尤其是对后有丝分裂的细胞特别有效，能增加细胞的转染率。第三个第三个原因是，就病毒载体本身而言，其可以在细胞中进行持续表达。转染方法转染方法 传统的寡脱氧核糖核酸和DNA质粒导入细胞的方法己成功地用于siRNA导入细胞的研究，然而到目前为止还没有一种siRNAs的转染方法能适宜对所有细胞类型的转染，所以必须优化转染条件以便获得最理想的基因沉默。通过研究发现细胞培养条件(包括细胞

10、密度和培养基组成)；转染的试剂类型和量；siRNA的质与量以及siRNA处理细胞的时间长短等转染参数都影响着转染和基因沉默的效果。为了增殖细胞subconfluent细胞密度是种极好的选择细胞密度最好是200500个mm2。转染最好是么没有血清的培养基中进，因为血清中的蛋白质会与siRNAs粘合或降解siRNAs。另外细胞的粘连与否对siRNAs的转染和靶基因的沉默是有影响的 在进行RISC(RNAinduced silencing complex)酶生物化学纯化的研究中，siRNA是RISC中最先得到的亚单位。通过对果蜗胚胎的溶解产物和S2细胞提取物中的RISC作进一步试管研究分析，在此基础

11、之广，创建了分离纯化该类复合体，以及鉴定其组成的方法。RISC是一种核糖核蛋白复合体，是由核算内切酶、核酸外切酶、解旋酶等组成，RISC具有切割mRNA活件的复活体、切割发生在与siRNA同源的mRNA上，这样靶mRNA被切割降解，最终不能再翻译成相应的蛋白质。RISCRISC：RNAiRNAi的催化引擎的催化引擎RNARNA诱导沉默复合体中的生物大分子及其装诱导沉默复合体中的生物大分子及其装配配 在RNA干扰(RNAi)的过程中，RISC的形成及其发挥作用的过程是RNAi的效应步骤。在整个RNAi的作用过程中，这一步是RNA发挥作用的最后阶段，同时也是最重要的阶段。RISC是一种多蛋白质复合

12、体，RISC由Dicer酶，Argonaute蛋白，siRNA等多种生物大分子装配而成。研究表明，RISC中的中的Dicer具有RNase结构域，在RNAi的起始阶段负责催化siRNA的产生，在RISC装配过程中起稳定RISC中间体结构和功能的作用;Argonaute蛋白蛋白是RISC中的核心蛋白，有PAZ和PIWI两个主要的结构域，前者为siRNA的传递提供结合位点，后者是RISC中的酶切割活性中心;siRNA是RISC完成特异性切割作用的向导，在成熟的RISC中虽然只包含siRNA的一条链，但siRNA在RISC形成过程中的双链结构是保证RNAi效应的决定因素。尽管RISC中还存在其他一些

13、功能未知的蛋白质，但在RISC组分结构及功能研究方而取得的进展为建立一个可能的RISC装配模型提供了理论基础。RISCRISC中的生物大分子中的生物大分子 Dicer酶 Argonaute蛋白家族 siRNA 其他大分子 Dicer（DCR）Dicer酶催化了RNA i过程中由双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)切割成siRNA的反应，随后与siRNA及其他蛋白一同参与RISC装配的起始。Dicer的分子结构中常含有具催化活性的RNase结构域和双链RNA结合结构域(dsRNA binding domain,dsRBD)。研究表明，在真核细胞中存在多个功能不同的Di

14、cer或Dicer类似蛋白(Dicer likeprotein,DCL)，它们在与 RNAi相关的不同途径或环节中分别或共同起作用。果蝇中的Dicer 1(DCR 1)负责催化miRNA前体的产生，Dicer 2(DCR 2)负责催化dsRNA切割成si RNA。拟南芥中的DCL1与DCL3分别与miRNA生物活性，催化产生重复序列和转座子siRNA及染色体沉默有关;而另外两种DCL(DCL2,DCL4)的功能未知。Argonaute蛋白家族蛋白家族Argonaute蛋白是RISC的核心组分，Argonaute家族蛋白具有PAZ和PIWI两个主要结构域。PAZ结构域高度保守，主要结构是一个由6

15、条链构成的左手桶(1-3，6-8)，在桶的一端连有2个螺旋(1,2)，另一端连一个组件(4，5，3)，在俘桶与a俘组件之间形成一个口袋状的结构，恰好可以插入siRNA 3末端突出的两个碱基，因此，PAZ是RISC中siRNA的结合位点。Argonaute蛋白除了起结合siRNA的作用外，另外一个重要的功能是催化RISC对靶RNA的特异性切割。研究表明，这个切割作用是由PIWI结构域完成的。siRNA(small interfering RNAs)：小干扰RNA，一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNA interfer

16、ence pathway）。其中有一个特异性的dsRNA核糖核酸酶家族RNase 家族与之密切相关，在实验研究中发现该类酶裂解产生的产物的特征与siRNAs极为相似。siRNA是RNAi复合体中的组成部分，可以通过果蝇胚胎溶解物中的dsRNA片段裂解成siRNA来获得小RNA。其他大分子其他大分子RISC中还存在其他一些功能未知的组分，大多数可以起到一个协同作用。但具体功能未知，还需要更深入的研究。例如：其中在人体内已经找到了dFXR同源物FMRP，但功能未知;VIG是一种富含RGG的蛋白质，这与锥虫中TbAGO1的N末端很相似，它是否也同TbAG01的功能一样参与Argonaute蛋白的切割

17、还不得而知;最近Scadden等发现Tudor SN可能同RNA腺普酸脱氨酶(adenosine deaminase that act on RNA,ADARs)对dsRNA的修饰过程共同起作用，协助RISC完成切割:首先，dsRNA在ADARs作用下将50%的腺普酸(A)变成次黄普酸(I)，而后，Tudor SN能够特异性地和高度富含IU,UI对的dsRNA结合，从而协助RISC完成切割作用。RISCRISC的装配的装配 装配的起始装配的起始 RISC组分的有序组装组分的有序组装 siRNA的解链的解链 miRNAmiRNA是一类长度很短的非编码单链小分子RNA，约2024 nt，由一段具有

18、发夹环结构的长度为7080 nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因问隔区。其转录独立于其他基因，并小翻译成蛋白质，而是在体内代谢过程中起到多种调控作用。Dicer与与miRNA哺乳动物中miRNA的成熟需要经历四个过程。首先从最原始的编码miRNA的基因组DNA转录形成miRNA的原始转录物(primary transcript,pri-miRNA),此过程需要RNA多聚酶II的参与，发生在细胞核中，接下来需要在Drosha的作用下生成pre-miRNA;然后，生成的pre-miRNA在输出蛋

19、白5(exportin-5,Exp-5)的协助下从细胞核中转运到细胞质中;最后，细胞质中的pre-miRNA在DCR的作用下剪切成2125 nt的双链成熟的mi RN。随后，成熟的miRNA将被组装进入RISC中形成非对称RISC复合体。该复合体会结合到目标靶mRNA上，在大多数情况卜，该复合体中的单链miRNA与靶mRNA的3 UTR小完全互补配对，从而阻断该基因的翻译过程。核糖核酸酶核糖核酸酶IIIIII超家族超家族 RNA干扰(RNAi)作为真核细胞转录后调节机制出现后，随着研究的进一步深入人们研究的焦点逐渐集中在核酸酶对双链RNA(dsRNA)的识别及降解方面。RNAi具有多种功能，它

20、的功能均与酶的活性有关。研究人员对RNAi的研究是希望能在生铡术和生物医学中得以应用。回顾早期的研究，这些研究发现了典型的dsRNA特异性酌即核糖核酸酶III。RNase III曾一度被认为是一种独特的细菌酶。尽管已经在许多的真核细胞中发现了dsRNA分解的作用，但是它与细菌RNase III之间的关系还不清楚。在对酶母RNA加工反应以及基因组测序工程的生化遗传等研究中。人们发现真菌、植物以及动物体内的RNase III是同源物。在此基础上最终形成了RNase III超家族概念。基因沉默中依赖于基因沉默中依赖于RNARNA的的RNARNA聚合酶聚合酶 在早期的分子生物学中，细胞中遗传信息的流程

21、图被定义为“中心法则：即从DNA到RNA的复制，从DNA到RNA的转录及从RNA到蛋白质的翻译。该框架图之外越来越吸引人们注意的一个途径是出依赖RNA的RNA聚合酶(RdRP)介导的从RNA到RNA的复制过程。当RNA为基本的遗传物质时，RdRP在其进化过程中一定发挥着重要的作用。这些酶在当代的生物学中同样右着关键的作用。RdRP出不同种RNA病毒进行编码，进行基因组的复制、mRNA的合成、RNA的重组和其他的一些功能。番茄RdRP是从健康的番茄叶及类病毒感染的叶子中分离出来的。为研究RdRP的生化性质，对纯化的蛋白质进行了分析。RdRP的引物要求的实验分析证明在有或无引物存在的情况下，该酶均

22、可以催化转录的进行。在与模板的3端互补的RNA或DNA的2个或3个核苷酸存在的情况下，均可以观察到引物的延伸。在缺乏引物时，RdRP在单链模板的3端核苷酸或其附近启动转录。尽管体外分析证明细胞内RdRP有催化活性，但应当清楚，纯化出来的蛋白质可能仅是较大的体内RdRP复合体的核心部分，其他蛋白质的存在可能会改变该酶的特异性及活性。RNA干扰可以由病毒的dsRNA、自身互补的转录本或者有义的转基因等激发。在植物中这种现象叫做共抑制。通过可以产生反义的或自身互补的转录本的复杂的转基因插入子，或者通过具有高表达水平的单链的转基因均可以激发共抑制。对于单链的有义的转基因，早熟的转录终端所引起的异常的转

23、录本可以在RdRP作用下，变为双链的RNA。RdRP为真菌、植物以及线虫中RNAi所必需，通过以siRNA为引物合成新的dsRNA。RdRP和和RNA沉默沉默RdRP的转基因沉默是由XRN4突变所引起的。XRN4是一种核酸酶通过去帽和53外切核酸酶的作用在mRNA的代谢中起作用。当XRN4和RdRP均发生突变时，去帽的转基因mRNA在植物中堆积。而这些缺乏帽子结构的mRNA则易于在RdRP作用下，启动并维持RNAi。不同的种系的证据表明RNA沉默的一些方面可能有细胞内RdRP的参与。在与有义转基因有关的肌沉默的早期实验中，用细胞内的将RdRP靶mRNA复制生成互补的RNA来解释沉默的序列特异性

24、。此外，也可通过向细胞中注入一些dsRNA的分子而在动物或植物体内诱导全身、并传递给子代的RNA沉默现像。RNAi是一种高度特异的过程，其发生过程主要分为3个阶段:首先，dsRNA在细胞内在DCR的作用下被切割成小的干扰性RNA，即siRNA。第二步为沉默复合体的形成。第三步为沉默复合体被激活。RNAiRNAi作用机制作用机制RNAiRNAi技术的特点技术的特点RNAi技术具有一些重要特点技术具有一些重要特点：高度特异性。放大性。高效性。遗传性。不对称性。扩散性RNAiRNAi操作的基本程序操作的基本程序 以植物细胞工程中应用的以植物细胞工程中应用的RNAi技术为例，技术为例，过程可以分成以下

25、几个环节：过程可以分成以下几个环节：确定目的基因；确定目的基因；设计设计RNAiRNAi序列；序列；获得获得RNAiRNAi产物；产物；RNAiRNAi转染；转染；检测检测RNAiRNAi的作用效果的作用效果RNARNA干扰技术干扰技术v核心技术：核心技术：siRNA siRNA（Small interfering RNA Small interfering RNA）的设）的设计与合成计与合成vsiRNAsiRNA的标记的标记vsiRNAsiRNA的转染的转染vRNAiRNAi的检测（核酸及蛋白水平）的检测（核酸及蛋白水平）siRNA的设计的设计1.siRNA的一般结构：哺乳动物：21-23b

26、p dsRNA 其它生物：更长的片段dTdT（UU）（UU）dTdTsiRNA的设计的设计设计流程（选择siRNA靶位点）从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点；根据5和3非翻译区（UTR)及靠近起始密码子（75个碱基之内）等富含调节蛋白结合位点区域来设计siRNA。将候选靶位点与相应的基因组数据库比较，去掉哪些与其它编码序列同源的靶序列。设计阴性对照：阴性对照siRNA应与siRNA的核苷酸组成相同但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变siRNA核苷酸顺序并经同源序列比较确证而得。序列同源性分析：序列同源性分析：将

27、将siRNA序列和相应的基因组数据库（人，或者小序列和相应的基因组数据库（人，或者小 鼠，鼠，大鼠等等）进行比较，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列排除那些和其他编码序列/EST同同源的序列源的序列。例如进行。例如进行BLAST搜索分析搜索分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成选出合适的目标序列进行合成 并非所有符合条件的并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择选择3-5个靶位点来设计个靶位

28、点来设计siRNA设计阴性对照设计阴性对照 通常的做法是将选中的通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查序列打乱，同样要检查 结果结果以保证它和其他基因没有同源性。或者用以保证它和其他基因没有同源性。或者用housekeeping genes 作对照作对照.补充：补充：Whitehead 研究所已研发了siRNA的自动选择方法，并于网站：http:/jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA/home.php 上向公众开放这个软件允许使用者定义序列基序和G/C含量，并自动在人和鼠的基因组数据库中搜索siRNA序列，以防错配。疑难解答：疑难解答：假如siRNA不起作用，应首先

29、确定所使用的靶序列和细胞是否来源于相同的组织。是否使用了错误的细胞系。应确定用于进行RNAi的siRNA双链对选择的mRNA序列是否可靠的，因后者可能包含序列上的错误、突变（如在癌细胞中）或存在多态性。siRNA的合成的合成体外转录法合成体外转录法合成 siRNA 双链双链 RNA合成合成 非特异非特异siRNA合成合成体内转录合成体内转录合成 siRNAl siRNA表达载体在细胞中表达表达载体在细胞中表达siRNAs l 以以PCR制备制备siRNA表达框进行体内转录表达框进行体内转录l 利用病毒系统实现体内表达利用病毒系统实现体内表达siRNA优点：不需要直接操作优点：不需要直接操作RN

30、A siRNA表达载体表达载体BD Knockout RNAi vectorspSIREN 载体分为两种：pSIREN-Shuttle和pSIREN-RetroQ。pSIREN 载体带有U6启动子，均为线性载体，pSIREN-RetroQ载体带有真核筛选标记-嘌呤霉素抗性基因pSIREN-Shuttle可以进一步应用于构建腺病毒载体；pSIREN-RetroQ可以进一步应用于构建逆转录病毒载体，应用于感染难以转染的细胞。siRNA表达框进行体内转录表达框进行体内转录siRNA表达框架(siRNA expresion casetes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。谢谢观赏WPS OfficeMake Presentation much more funWPS官方微博kingsoftwps