IgG抗体的提取及鉴定总结课件.ppt
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- 关 键 词:
- IgG 抗体 提取 鉴定 总结 课件
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1、医学免疫学与免疫学技术实验医学免疫学与免疫学技术实验贵阳医学院免疫学教研室贵阳医学院免疫学教研室人血清人血清IgG的提取及鉴定的提取及鉴定2014-04-22人血清人血清IgG的提取及鉴定的提取及鉴定离子交换层析法提取人离子交换层析法提取人IgG血清血清IgG鉴定鉴定人血清人血清IgG的提取及鉴定的提取及鉴定离子交换层析法提取人离子交换层析法提取人IgG流程:流程:u DEAE-纤维素预处理、采集样品(血清)纤维素预处理、采集样品(血清)u 装柱、平衡装柱、平衡u 上样和洗脱上样和洗脱u DEAE-纤维素再生纤维素再生人血清人血清IgG鉴定鉴定:u 洗脱液抗原性鉴定洗脱液抗原性鉴定琼脂双扩散琼
2、脂双扩散u 纯度鉴定纯度鉴定免疫电泳免疫电泳u 回收率的测定回收率的测定分光光度法分光光度法u IgG回收量的测定回收量的测定-直接直接ELISA离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理 离子交换层析(离子交换层析(Ion Exchange Chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定)是以离子交换剂为固定相,特定的离子溶液为流动相,依据各种离子或相,特定的离子溶液为流动相,依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的离子化合物与离子交换剂的结合力不同结合力不同进行分离进行分离纯化的层析方式。纯化的层析方式。离子交换层析的基本过程离子交换层析的基本过程 带电荷量少,亲和力小的先被洗
3、脱下来,带电荷量多,带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来,带电荷量多,亲和力大的后被洗脱下来。亲和力大的后被洗脱下来。离子交换剂离子交换剂 在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂离子交换剂。纤维素纤维素OCH2COO-Na 基质基质 电荷基团电荷基团 反离子反离子阴离子交换剂阴离子交换剂二乙氨乙基纤维素,弱碱性二乙氨乙基纤维素,弱碱性DEAE-纤维素(纤维素(阴离子交换纤维素阴离子交换纤维素)在)在 pH8.6以下分离中性或酸性物质。以下分离中性或酸性物质。人人IgG的主要理化性质及的主要理化性质及DEAE-纤维素提取原理纤维素提取原理人人IgG特性特
4、性:血清含量:血清含量:9.5-12.5 mg/ml;血清中的;血清中的IgG属属于中性蛋白(于中性蛋白(pI:6.85-7.5),其余均属酸性蛋白),其余均属酸性蛋白(pI:4-5)。)。DEAE-纤维素提取纤维素提取IgG原理:原理:在在pH7.27.4的环境中,酸性蛋白被的环境中,酸性蛋白被DEAE-纤维素吸附,纤维素吸附,IgG不被吸附而最早从柱中流出,不被吸附而最早从柱中流出,而得以纯化。而得以纯化。实验步骤1、DEAE-纤维素预处理:纤维素预处理:强碱处理强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤(抽滤、洗涤、抽滤(pH8.0)强酸处理强酸处理 0.5N HCl 抽滤、洗涤、抽
5、滤(抽滤、洗涤、抽滤(pH8.0)强碱处理强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤(抽滤、洗涤、抽滤(pH8.0)PH7.4 0.01M PB液浸泡液浸泡抽滤、浸泡抽滤、浸泡2、装柱、平衡固定层析柱、装柱、平衡固定层析柱 装装 柱:柱高度、无分层、无气泡柱:柱高度、无分层、无气泡3、样本(人血清)准备、样本(人血清)准备 抽静脉血抽静脉血分离血清分离血清透析(透析(PH7.4 0.01M PB液液 4度过夜)度过夜)4、研磨蔗糖备用(纯化、研磨蔗糖备用(纯化IgG浓缩用)浓缩用)实验步骤5、上样、洗脱、收集洗脱液、上样、洗脱、收集洗脱液 上样上样 流速流速3ml/10min(记录上样总体
6、积,保留部分血清)(记录上样总体积,保留部分血清)洗脱洗脱 流速流速30-40ml/cm2/h 收集收集 5ml/管管(20%三氯醋酸滴定、分光光度法检测)三氯醋酸滴定、分光光度法检测)6、DEAE-纤维素再生纤维素再生 2M NaCl 洗脱其他血清蛋白洗脱其他血清蛋白 拆柱、拆柱、浸泡浸泡 PH7.4 0.01M PB液液洗脱液抗原性鉴定洗脱液抗原性鉴定双向琼脂扩散实验原理:双向琼脂扩散实验原理:可溶性可溶性Ag和和Ab分别在琼脂凝胶内扩散。分别在琼脂凝胶内扩散。相应的相应的Ag和和Ab相遇后,在比例合适时可形成相遇后,在比例合适时可形成白色沉淀线。白色沉淀线。7、洗脱液抗原性鉴定(双扩散法
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