时间分辨荧光免疫分析课件.ppt

1、时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析开展历程开展历程 19791979年，可标记抗体的年，可标记抗体的Eu3+-Eu3+-二酮体二酮体-EDTA-EDTA 19831983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定定HCGHCG和磷酸酯酶和磷酸酯酶A A“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究获套研究获20032003年度国家科技进步二等奖年度国家科技进步二等奖2021/1/122开展历程1 9 7 9 年，可标记抗体的E u 3+-二酮体-E D T一、时间分辨荧光免疫分析特点一、时间分辨荧光

2、免疫分析特点2021/1/123一、时间分辨荧光免疫分析特点2 0 2 1/1/1 2 31.1.荧光衰减时间长荧光衰减时间长镧系元素荧光衰变时间2021/1/1241.荧光衰减时间长镧系元素荧光衰变时间2 0 2 1/1/1 2 4常见荧光物质荧光寿命常见荧光物质荧光寿命荧光物质荧光物质荧光寿命荧光寿命Eu3+714 s非特异性荧光背景非特异性荧光背景1-10 ns人血清白蛋白人血清白蛋白4.1 ns人球蛋白、血红蛋白人球蛋白、血红蛋白3.0 ns细胞色素细胞色素C3.5 nsFITC4.5 ns丹磺酰氯丹磺酰氯14 ns苯胺萘磺酸苯胺萘磺酸16 ns稀土螯合物稀土螯合物104-106 ns

3、2021/1/125常见荧光物质荧光寿命荧光物质荧光寿命E u 3+7 1 4 s 非特2.Stokes位移大位移大 荧光物质荧光物质激发波长激发波长发射波长发射波长Stokes位移位移Eu-(-NTA)3340 nm613 nm273 nmSm-(-NTA)3340 nm600 nm260 nmTb-(PTA)3295 nm490/543 nm195/248 nmDy-(PTA)3295 nm573 nm278 nm2021/1/1262.S t o k e s 位移大 荧光物质激发波长发射波长S t o k e镧系元素发射峰窄2021/1/127镧系元素发射峰窄2 0 2 1/1/1 2

4、7优点优点 灵敏度高10-18mol/孔 原子标记 多标记技术2021/1/128优点2 0 2 1/1/1 2 8二、时间分辨荧光免疫分析体系二、时间分辨荧光免疫分析体系 非均相时间分辨荧光免疫分析非均相时间分辨荧光免疫分析 均相时间分辨荧光免疫分析均相时间分辨荧光免疫分析2021/1/129二、时间分辨荧光免疫分析体系2 0 2 1/1/1 2 9一非均相时间分辨荧光免疫分析一非均相时间分辨荧光免疫分析 时间分辨固相免疫分析时间分辨固相免疫分析 解离增强荧光免疫分析解离增强荧光免疫分析 酶放大免疫分析酶放大免疫分析2021/1/1210一非均相时间分辨荧光免疫分析2 0 2 1/1/1 2

5、 1 01.1.时间分辨固相免疫分析时间分辨固相免疫分析灵敏度一般不高灵敏度一般不高2021/1/12111.时间分辨固相免疫分析灵敏度一般不高2 0 2 1/1/1 2 1 1 实例实例 加拿大加拿大Cyber Fluor的的FIAgen系统系统 Eu3+-BCPDA为标记物为标记物2021/1/1212实例2 0 2 1/1/1 2 1 22.2.解离增强分析解离增强分析原理示意图原理示意图2021/1/12132.解离增强分析原理示意图2 0 2 1/1/1 2 1 31 1双功能螯合剂双功能螯合剂 EDTA衍生物、衍生物、DTTA衍生物、衍生物、DTPA衍生物衍生物 一端与镧系离子螯合

6、，一端与抗原一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接抗体连接 近中性时，螯合物足够稳定近中性时，螯合物足够稳定 酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放 Eu-DTTA应用最广泛应用最广泛2021/1/12141 双功能螯合剂E D T A 衍生物、D T T A 衍生物、D T P A 衍2 2增强液增强液增强原理图增强原理图一般增强百万倍一般增强百万倍2021/1/12152 增强液增强原理图2 0 2 1/1/1 2 1 5-NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2复合物复合物 TOPO：荧光增强协同剂：荧光增强协同剂 Triton X-100：外表活性剂，形

7、成胶束：外表活性剂，形成胶束 醋酸：酸性介质醋酸：酸性介质2021/1/1216-N T A：E u(-N T A)3(T O P O)2 复合物2 0 2 13 3酶放大酶放大 酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复合物螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复合物 ALP2021/1/12173 酶放大酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生酶放大免疫分析示意图酶放大免疫分析示意图2021/1/1218酶放大免疫分析示意图2 0 2 1/1/1 2 1 8双标记测定双标记测定AFPAFP和和-hCG-hCG-NTA作为

8、螯合剂作为螯合剂340 nm 激发，激发，Eu:615 nm,820 s；Sm:643 nm,88 s2021/1/1219双标记测定A F P 和-h C G -N T A 作为螯合剂2 0 2 1/1二均相免疫分析二均相免疫分析 基于时间分辨荧光共振能量转移 无需洗涤、别离、加增强液2021/1/1220二均相免疫分析2 0 2 1/1/1 2 2 0 TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射二吡啶二胺，最大发射615nm，供体，供体 APC：别藻蓝蛋白，最大发射：别藻蓝蛋白，最大发射665nm，受体，受体 能量转移效率最高的供体能量转移效率最高的供体/受体对受体对2021/1/122

9、12 0 2 1/1/1 2 2 1时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图2021/1/1222时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图2 0 2 1/1/1 2 2 2三、时间分辨免疫分析方法三、时间分辨免疫分析方法 夹心法夹心法 竞争法竞争法 间接法 捕获法 生物素-亲和素放大法2021/1/1223三、时间分辨免疫分析方法夹心法2 0 2 1/1/1 2 2 31.夹心法夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法2021/1/12241.夹心法双抗体夹心法2 0 2 1/1/1 2 2 4双抗原夹心法双抗原夹心法2021/1/1225双抗原夹心法2 0 2 1/1

10、/1 2 2 52.竞争法竞争法2021/1/12262.竞争法2 0 2 1/1/1 2 2 63.间接法间接法间接法测定间接法测定HCV抗体抗体2021/1/12273.间接法间接法测定H C V 抗体2 0 2 1/1/1 2 2 74.捕获法捕获法捕获法测定抗捕获法测定抗-CMV IgM2021/1/12284.捕获法捕获法测定抗-C MV I g M2 0 2 1/1/1 25.生物素生物素-亲和素法亲和素法生物素生物素-亲和素检测亲和素检测PAPP-A2021/1/12295.生物素-亲和素法生物素-亲和素检测P A P P-A 2 0 2 1四、应用四、应用 1.1.肿瘤标志物检

11、测肿瘤标志物检测 2.2.传染病检测传染病检测 3.3.糖尿病检测糖尿病检测 4.4.激素检测激素检测 5.5.细胞活性检测细胞活性检测2021/1/1230四、应用2 0 2 1/1/1 2 3 01.肿瘤标志物 AFP测定：双抗体夹心法 固相包被抗体 参加样品或标准品 参加Eu标记抗体 参加增强液 测定荧光 灵敏度：0.17 U/ml2021/1/12311.肿瘤标志物A F P 测定：双抗体夹心法2 0 2 1/1/1 2 3 12.传染病检测 梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法 强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照 阴性对照、阳性对照和样品参加板上，孵育 参加铕标记抗原，孵育 参加增强

12、液，检测荧光 符合中国药品生物制品鉴定所结果2021/1/12322.传染病检测梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法2 0 2 1/13.糖尿病检测 C-肽检测：双抗体夹心法 抗体包被微孔板 参加标准品或样品 参加铕标记抗体 增强液，检测荧光 灵敏度：2021/1/12333.糖尿病检测C-肽检测：双抗体夹心法2 0 2 1/1/1 2 3 34.激素检测 三碘甲状腺原氨酸T3：竞争法 微孔板中参加抗体 标准品或样品、铕标记T3 参加增强液，测定荧光 灵敏度：2021/1/12344.激素检测三碘甲状腺原氨酸T 3：竞争法2 0 2 1/1/15.细胞活性检测测定细胞活性原理图T T：靶细胞：靶细

13、胞E E：效应细胞：效应细胞2021/1/12355.细胞活性检测测定细胞活性原理图T：靶细胞2 0 2 1/1/1NK细胞活性 靶细胞：K562细胞 参加EuCl3,DTPA,硫酸葡聚糖，4C孵育 向靶细胞中参加效应细胞NK细胞，孵育，离心，测上清荧光 计算比释放率%2021/1/1236N K 细胞活性靶细胞：K 5 6 2 细胞2 0 2 1/1/1 2 3 6谢谢NoImage内容总结时间分辨荧光免疫分析。1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A。“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究获2003年度国家科技进步二等奖22021/1/12。2021/1/12。常见荧光物质荧光寿命。104-106 ns。EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物。一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接。340 nm 激发，Eu:615 nm,820 s。谢谢内容总结时间分辨荧光免疫分析。1 9 8 3 年，建立时间分辨荧光免