免疫组织化学原理及应用12级课件.ppt

1、l 孙勤暖l组织学与细胞学、组织化学、生物化学、组织学与细胞学、组织化学、生物化学、免疫组织化学免疫组织化学l组织学、细胞学与组织化学区别：组织学、细胞学与组织化学区别：l 1、组织、细胞学是研究形态结构与功能、组织、细胞学是研究形态结构与功能的关系的关系l 2、组织化学是研究组织细胞内的化学成、组织化学是研究组织细胞内的化学成分及其含量或酶的存在及其活性分及其含量或酶的存在及其活性l l组织化学概念组织化学概念:=细胞化学细胞化学l 是运用物理、化学、免疫学和分子生物是运用物理、化学、免疫学和分子生物学等原理，对组织与细胞化学成分或酶活性学等原理，对组织与细胞化学成分或酶活性进行定性、定位和

2、定量的研究的科学。进行定性、定位和定量的研究的科学。l传统组织化学概念：传统组织化学概念：l 是运用物理、化学是运用物理、化学l 免疫学、电镜技术和分子生物学技术的发免疫学、电镜技术和分子生物学技术的发展免疫组织化学、免疫电镜组织化学、原位展免疫组织化学、免疫电镜组织化学、原位杂交技术等杂交技术等l广义组织化学包括：广义组织化学包括：l 传统组织化学、传统组织化学、l 免疫组织化学、免疫组织化学、l 电镜组织化学、电镜组织化学、l 免疫电镜组织化学、免疫电镜组织化学、l 原位杂交组织化学等原位杂交组织化学等l生物化学与组织化学区别：生物化学与组织化学区别：l生物化学：生物化学：l 1、运用化学

3、原理分析细胞的组成成分以及这些、运用化学原理分析细胞的组成成分以及这些成分在生命过程中的化学反应。成分在生命过程中的化学反应。l 2、生物化学将组织细胞制成匀浆研究（结构被、生物化学将组织细胞制成匀浆研究（结构被破坏）破坏）l 3、生物化学的化学反应在试管内或容器内、生物化学的化学反应在试管内或容器内l 4、生物化学的化学反应结果观察不用显微镜、生物化学的化学反应结果观察不用显微镜l 5、产物需要分离、提纯、鉴定。、产物需要分离、提纯、鉴定。l组织化学：组织化学：l 运用化学反应原理在组织细胞内对组织细胞运用化学反应原理在组织细胞内对组织细胞化学成分进行定性、定位和定量的研究。产物多化学成分进

4、行定性、定位和定量的研究。产物多需要显色剂显示。如：利用酶的特性需要显色剂显示。如：利用酶的特性l一、免疫组织化学技术的基本原理：一、免疫组织化学技术的基本原理：免疫组织化学技术是利用抗原免疫组织化学技术是利用抗原与抗体能特异性结合的基本特点，与抗体能特异性结合的基本特点，通过显示剂的显示通过显示剂的显示,确定某些抗原或确定某些抗原或抗体的有无或其存在的位置，来研抗体的有无或其存在的位置，来研究某事物的特性。究某事物的特性。二、组织化学与免疫组织化学技术的区别二、组织化学与免疫组织化学技术的区别l 组织化学技术组织化学技术：（HE 特殊染色）特殊染色）l 通过应用某些能与组织、细胞化学成通过应

5、用某些能与组织、细胞化学成分特异性结合的显色试剂，定位的显示组织、分特异性结合的显色试剂，定位的显示组织、细胞的特殊化学成分的一门技术。细胞的特殊化学成分的一门技术。l 优点：既保存原有的形态改变又显示特殊优点：既保存原有的形态改变又显示特殊化学成分达到形态、功能与代谢相结合。化学成分达到形态、功能与代谢相结合。l l （不敏感、特异性差）（不敏感、特异性差）二、组织化学与免疫组织化学技术的区别二、组织化学与免疫组织化学技术的区别l l免疫组织化学技术免疫组织化学技术：l 将抗原、抗体反应的特异性与组织化学将抗原、抗体反应的特异性与组织化学反应的可见性结合在一起，形成了反应的可见性结合在一起，

6、形成了免疫免疫组织组织化学技术。化学技术。l 优点：优点：l 1、形态、功能与代谢相结合（微量）、形态、功能与代谢相结合（微量）l 2、检测的成分更加广泛、敏感、特异性、检测的成分更加广泛、敏感、特异性更强更强l三、三、免疫组织化学技术的发展免疫组织化学技术的发展l免疫荧光技术免疫荧光技术 抗体酶标法抗体酶标法 l多克隆抗体技术多克隆抗体技术 单克隆抗体技术单克隆抗体技术l ABC法、法、S-P法等法等 原位杂交及原位原位杂交及原位PCR等免疫组化法。等免疫组化法。l四、四、免疫组织化学技术的优点免疫组织化学技术的优点l1、特异性强、特异性强l2、敏感性高、敏感性高l3、定位准确、定位准确l4

7、、形态、功能与代谢相结合、形态、功能与代谢相结合l 五、五、免疫组织化学方法免疫组织化学方法l 免疫组织化学免疫组织化学lImmunohistochemistry Immunocytochemistry1、特异性的抗原和特异性的抗体（结合）、特异性的抗原和特异性的抗体（结合）2、显色系统、显色系统显示剂：酶显示剂：酶,金属原子金属原子,荧光分子荧光分子 同位素分子同位素分子酶底物：酶底物：DAB(3,3-二胺基联苯胺二胺基联苯胺)AEC(3-氨基氨基-9-乙基卡巴唑乙基卡巴唑)坚牢蓝，坚牢红坚牢蓝，坚牢红.（一）直接法（一）直接法:酶标法（一步法）酶标法（一步法）将酶（将酶（HRP）标记在特异

8、抗体上，）标记在特异抗体上，方法简捷方法简捷,需要标记所有抗体需要标记所有抗体 Ag Ab-HRP.底物底物-显色剂显色显色剂显色（一）直接法（一）直接法:酶标法（一步法）酶标法（一步法）将酶（将酶（HRP）标记在特异抗体上，）标记在特异抗体上，方法简捷方法简捷,需要标记所有抗体需要标记所有抗体.AgAb-HRP（一）直接法（一）直接法:酶标法（一步法）酶标法（一步法）将酶（将酶（HRP）标记在特异抗体上，）标记在特异抗体上，方法简捷方法简捷,需要标记所有抗体需要标记所有抗体.AgAb-HRP AgAb-HRP（一）直接法（一）直接法:酶标法（一步法）酶标法（一步法）将酶（将酶（HRP）标记在

9、特异抗体上，）标记在特异抗体上，方法简捷方法简捷,需要标记所有抗体需要标记所有抗体.AgAb-HRP 底物底物-显色剂显色显色剂显色 AgAb-HRP（一）直接法（一）直接法:酶标法（一步法）酶标法（一步法）将酶（将酶（HRP）标记在特异抗体上，）标记在特异抗体上，方法简捷方法简捷,需要标记所有抗体需要标记所有抗体.AgAb-HRP 底物底物-显色剂显色显色剂显色 AgAb-HRP底物底物-显色剂显色剂显色显色 需要标记所有抗体需要标记所有抗体（二）间接法（二）间接法:二步法二步法 将酶（将酶（HRP）标记在第二抗体上，）标记在第二抗体上，.Ag Ab1 Ab2-HRP 底物底物-显色剂显色显

10、色剂显色 二步法二步法,应用范围广应用范围广;不需标记一不需标记一抗抗,只需标记几个种属的二抗即可只需标记几个种属的二抗即可（二）间接法（二）间接法:二步法二步法 将酶（将酶（HRP）标记在第二抗体上，）标记在第二抗体上，.Ag Ab1 Ag-Ab1 （二）间接法（二）间接法:二步法二步法 将酶（将酶（HRP）标记在第二抗体上，）标记在第二抗体上，.Ag Ab1 Ab2-HRP Ag-Ab1-Ab2-HRP （二）间接法（二）间接法:二步法二步法 将酶（将酶（HRP）标记在第二抗体上，）标记在第二抗体上，.Ag Ab1 Ab2-HRP 底物底物-显色剂显色显色剂显色 Ag-Ab1-Ab2-HR

11、P-底物底物-显色剂显色剂显色显色 二步法二步法,应用范围广应用范围广;不需标记一抗不需标记一抗,只只需标记几个种属的二抗即可需标记几个种属的二抗即可l Envision Systeml 是将二抗是将二抗 和和 HRP 通过一个多聚葡聚通过一个多聚葡聚l糖骨架连接成一个多聚体，多聚体中没有糖骨架连接成一个多聚体，多聚体中没有生物素参与，所以它不受内源性生物素的生物素参与，所以它不受内源性生物素的影响，使背景染色降低。影响，使背景染色降低。l特点：敏感、省时、方便、背景低特点：敏感、省时、方便、背景低（三）三步法（三）三步法:将酶（将酶（HRP）标记在复合物上）标记在复合物上 1、PAP法法 （

12、三）三步法（三）三步法:将酶（将酶（HRP）标记在复合物上）标记在复合物上 1、PAP法法 2、ABC法法 （三）三步法（三）三步法:将酶（将酶（HRP）标记在复合物上）标记在复合物上 1、PAP法法 2、ABC法法 3、S-P法法链霉菌抗生物素蛋白链霉菌抗生物素蛋白抗原一抗二抗生物素酶组织组织生物素生物素卵白素卵白素链霉菌抗生链霉菌抗生物素蛋白物素蛋白4、四步法、五步法四步法、五步法 5、多重标记多重标记:在同一组织或细胞上显示两种以上在同一组织或细胞上显示两种以上抗原。抗原。SP法法 ABC法法 48倍倍 SP法法 PAP法法 2550倍倍 l一、取材：一、取材：l二、固定、脱水、透明、浸

13、蜡、包埋、二、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、l 切片、切片、l 捞片捞片、烤片、脱蜡、水化、烤片、脱蜡、水化l三、玻片处理：防脱片胶三、玻片处理：防脱片胶l APES Poly-L-Lysinl三、防脱片处理步骤三、防脱片处理步骤l（一）载玻片和盖玻片的处理（一）载玻片和盖玻片的处理l 将载玻片或培养用的小盖片浸泡在重将载玻片或培养用的小盖片浸泡在重铬酸钾浓硫酸清洁液中铬酸钾浓硫酸清洁液中24小时，然后流水小时，然后流水充分冲洗，再用蒸馏水冲洗充分冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍以上，而后遍以上，而后置置95%乙醇中乙醇中12小时。取出擦干或烤干，小时。取出擦干或烤干，贮放于玻片盒内备用。贮放于玻片盒

14、内备用。l 盖玻片很薄，以上处理程序必须缩短盖玻片很薄，以上处理程序必须缩短时间，清洁液浸泡只需时间，清洁液浸泡只需2小时，流水冲洗注小时，流水冲洗注意勿损伤玻片。意勿损伤玻片。l（二）黏附剂的使用（二）黏附剂的使用l1、多聚左旋赖氮酸（、多聚左旋赖氮酸（poly-l-lysine）l 首先配制首先配制0.1%多聚左旋赖氮酸浓缩液（配多聚左旋赖氮酸浓缩液（配方见附录一），室温下（方见附录一），室温下（1826）可保存）可保存1年。年。使用时，将试剂使用时，将试剂10倍稀释成工作液，浓度为倍稀释成工作液，浓度为0.01%，28冰箱保存，有效期冰箱保存，有效期3个月。个月。l 使用方法是将充分洗净

15、和预先干燥的玻片浸使用方法是将充分洗净和预先干燥的玻片浸泡于稀释后的多聚左旋赖氨酸深液数十秒或提拉泡于稀释后的多聚左旋赖氨酸深液数十秒或提拉十次，沥干，于室温下晾干十次，沥干，于室温下晾干1224小时或在小时或在45以下烤箱内烘干。处理后的玻片避光干燥可长期以下烤箱内烘干。处理后的玻片避光干燥可长期保存。保存。l2、3-氨丙基氨丙基-乙氧基甲硅烷（乙氧基甲硅烷（3-amino propyltriethoxy silane,APES）l APES必须现用现配。用此方法黏合的玻片应必须现用现配。用此方法黏合的玻片应垂直烤片而不能水平烤片，否则，组织片中易出垂直烤片而不能水平烤片，否则，组织片中易出

16、现气泡。现气泡。l APES的使用方法：用丙酮的使用方法：用丙酮50倍稀释（倍稀释（APES 1份、丙酮份、丙酮49份混合），将洗净的玻片放入稀释好份混合），将洗净的玻片放入稀释好的的APES中，停留中，停留2030秒，取出稍停，再入纯丙秒，取出稍停，再入纯丙酮或蒸馏水中涮去未结合的酮或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾，置通风橱中晾干即可。注意用干即可。注意用APES防脱片处理的载玻片捞片时防脱片处理的载玻片捞片时组织应一步到位，并尽量减少气泡存在，以免影组织应一步到位，并尽量减少气泡存在，以免影响染色结果。响染色结果。l 注意不要将注意不要将APES与其他防脱片剂混合使用。与其他防

17、脱片剂混合使用。l 多聚左旋赖氨酸为目前免疫组织化学多聚左旋赖氨酸为目前免疫组织化学染色中最常用的防脱片剂，适合于需要酶染色中最常用的防脱片剂，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。消化、微波、高温高压的防脱片处理。l 如效果不佳，可用双重处理（如效果不佳，可用双重处理（APES和和poly-l-lysine）的切片。）的切片。l 在以上两种方法均无效的情况下，可在以上两种方法均无效的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前放在用如下方法：切片在脱蜡前放在APES 1：50丙酮溶液中浸泡丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干后即可进行分钟，晾干后即可进行下一步骤。下一步骤。l 对对HE染色的切片，可在载

18、玻片上涂染色的切片，可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油。抹薄层蛋白甘油。l一、取材：一、取材：l二、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、二、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、l 捞片捞片、烤片、脱蜡、水化、烤片、脱蜡、水化l三、玻片处理：防脱片胶三、玻片处理：防脱片胶l APES Poly-L-Lysinl四、抗原修复四、抗原修复l化学法：胰蛋白酶、胃胰蛋白酶、链霉蛋白化学法：胰蛋白酶、胃胰蛋白酶、链霉蛋白l 酶、尿素等酶、尿素等l物理法：单纯加热、高压加热、微波加热物理法：单纯加热、高压加热、微波加热l 10分钟分钟 90120秒秒 10分钟分钟 组 织Ab固定液PH值 3.05.07.08.0

19、10抗原修复液PH值6.0皮肤AE1/AE3-胃粘膜EMA+子宫肌瘤SMA+乳腺癌ER+7.0皮肤AE1/AE3-胃粘膜EMA+子宫肌瘤SMA+乳腺癌ER+8.0皮肤AE1/AE3+胃粘膜EMA+子宫肌瘤SMA+乳腺癌ER+EDTA 8.0皮肤AE1/AE3+胃粘膜EMA+子宫肌瘤SMA+乳腺癌ER+l 免疫组化染色步骤：免疫组化染色步骤：l（一）（一）S-P法染色步骤法染色步骤:l1、石蜡切片脱蜡和水化后，用、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（PH=7.4)l 冲洗三次冲洗三次,每次三分钟（每次三分钟（33）。）。l2、根据每一种抗体的要求，对组织进行相应、根据每一种抗体的要求，对组织进行相应

20、l 的修复。的修复。l3、每张切片滴加一滴或、每张切片滴加一滴或50l 3%H2O2l （试剂（试剂 A），室温下孵育室温下孵育10分钟，以阻断分钟，以阻断l 内源性过氧化物酶。内源性过氧化物酶。l4、PBS冲洗（冲洗（33 ）l5、甩取、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或液，每张切片滴加一滴或50ll 的非免疫动物血清（试剂的非免疫动物血清（试剂 B），室温下孵），室温下孵l 育育10分钟。分钟。l6、甩取血清，每张切片滴加一滴或、甩取血清，每张切片滴加一滴或50l第一第一l 抗体，室温下孵育抗体，室温下孵育60分钟或分钟或4C过夜。过夜。l7、PBS冲洗（冲洗（35 ）l8、甩取、甩取PBS

21、液，每张切片滴加一滴或液，每张切片滴加一滴或50ll 的第二抗体（试剂的第二抗体（试剂 C），室温下孵育、，室温下孵育、l 10分钟分钟l9、PBS冲洗（冲洗（33 ）l10、甩取、甩取PBS液，每张切片滴加一滴液，每张切片滴加一滴50ll 的链霉菌抗生物素的链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液过氧化物酶溶液l （试剂（试剂 D），室温下孵育，室温下孵育10分钟。分钟。l11、PBS冲洗（冲洗（33 ）l12、甩取、甩取PBS液，每张切片滴加液，每张切片滴加2滴滴100ll 的的DAB或或AEC显色液，显微镜下观察显色液，显微镜下观察l 3-10分钟，阳性显色为棕色或红色。分钟，阳性显色为棕色或红色

22、。l13、自来水冲洗，苏木素复染，、自来水冲洗，苏木素复染，0.1%HCLl 分化分化0.1%氨水或氨水或PBS冲洗返蓝。冲洗返蓝。l 14、如果用、如果用DAB显色，则切片通过梯度酒显色，则切片通过梯度酒l 精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；l如果用如果用AEC显色，则切片不能用酒精脱显色，则切片不能用酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。水，而直接用水性封片剂封片。l 如果组织内源性生物素含量高或由于如果组织内源性生物素含量高或由于热修复造成内源性生物暴露，可在加热修复造成内源性生物暴露，可在加3%H2O2之前，用内源性生物素阻断剂之前，用内源性生物素阻断剂l

23、加以阻断之后继续免疫组化染色。加以阻断之后继续免疫组化染色。（二）（二）Envision法染色步骤法染色步骤:l1、石蜡切片脱蜡和水化后，用、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（PH=7.4)l 冲洗三次冲洗三次,每次三分钟（每次三分钟（33）。）。l2、根据每一种抗体的要求，对组织进行相应、根据每一种抗体的要求，对组织进行相应l 的修复。的修复。l3、每张切片滴加一滴或、每张切片滴加一滴或50l 3%H2O2 室温室温l 下孵育下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。分钟，以阻断内源性过氧化物酶。l4、PBS冲洗（冲洗（33 ）l5、甩取甩取PBS液，每张切片滴加一滴或液，每张切片滴加一滴或50

24、ll 第一抗体，室温下孵育第一抗体，室温下孵育60分钟或分钟或4C过夜。过夜。l6、PBS冲洗（冲洗（35 ）l7、甩取、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或液，每张切片滴加一滴或50l聚聚l 合物增强剂（试剂合物增强剂（试剂 A），室温下孵育室温下孵育20分分l 钟。钟。l8、PBS冲洗（冲洗（33 ）l9、甩取、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或液，每张切片滴加一滴或50l酶酶l 标抗鼠标抗鼠兔聚合物，兔聚合物，（试剂（试剂 B）室温下孵）室温下孵l 育育30分钟。分钟。l10、PBS冲洗（冲洗（33 ）l11、甩取、甩取PBS液，每张切片滴加液，每张切片滴加2滴滴100ll 的的DAB或或AE

25、C色液，显微镜下观察色液，显微镜下观察l 3-10分钟阳性显色为棕色或红色。分钟阳性显色为棕色或红色。l12、自来水冲洗，苏木素复染，、自来水冲洗，苏木素复染，0.1%HCLl 分化分化0.1%氨水或氨水或PBS冲洗返蓝。冲洗返蓝。l 13、如果用、如果用DAB显色，则切片通过梯度酒显色，则切片通过梯度酒l 精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；l 如果用如果用AEC显色，则切片不能用酒显色，则切片不能用酒l 精脱水，而直接用水性封片剂封片。精脱水，而直接用水性封片剂封片。l 免疫组化在肿瘤研究中的应用免疫组化在肿瘤研究中的应用 1、提高病理诊断的准确性，确定肿瘤

26、来、提高病理诊断的准确性，确定肿瘤来源及类型。源及类型。通过检测细胞骨架抗原（如通过检测细胞骨架抗原（如CK,Vimetin,Desmin,GFAP等）等）;细胞功能产细胞功能产物抗原（如激素，免疫球蛋白，物抗原（如激素，免疫球蛋白，NSE,CgA等）等）;细胞表型标记物，属细胞膜抗原（如细胞表型标记物，属细胞膜抗原（如LCA,EMA)及各种淋巴细胞表型）和胚胎及各种淋巴细胞表型）和胚胎期抗原（如期抗原（如CEA,AFP).确定肿瘤来源确定肿瘤来源 l胰腺:l腺泡细胞癌：CK8+、CK18+l导管分化癌：CK7+、CK19+l肝脏肿瘤Hep-par-1AFPCK8CK18CK7CK19CK高C

27、K低CA19-9CK20HCC+/_+-/+-/+ICC+-/+/+-/+MAC胃肠道转移性腺癌+/_+l甲状腺及滤泡旁细胞l 甲状腺滤泡上皮发生癌 髓样癌l 1、Tg +l 2、TTF-1 +l 3、Syn +l 4、Cg-A +l 5、Calcitonin +l 6、CEA 少+多+l 乳头状癌 正常l CK高 +l Galectin-3/HBME-1 +l CK19 +l Vimitin +l S-100 +l P53 +l MC +l CD56 +l甲状旁腺l PTH +（甲状旁腺激素）l Syn+、Cg-A+、CK8+、CK18+、CK19+l Ki-675注意复查l 类癌、不典型类

28、癌、小细胞癌lTTF-1 +/-+lKi-67 4050 60 80lCD57 +lCD56 +l SYN +lCgA +lNSE +l l男性生殖系统男性生殖系统l前列腺疾病前列腺疾病l一、前列腺的标记物一、前列腺的标记物l 1、前列腺特异性抗原（、前列腺特异性抗原（PSA）（浆（浆+）l正常：在雄激素的调节下腺泡上皮、导管上皮分泌正常：在雄激素的调节下腺泡上皮、导管上皮分泌l 是前列腺来源的肿瘤的敏感、特异的标记物，但不能是前列腺来源的肿瘤的敏感、特异的标记物，但不能区分良恶性区分良恶性l （1）前列腺腺泡上皮、导管上皮：顶端胞质）前列腺腺泡上皮、导管上皮：顶端胞质+l （2）良性增生上皮

29、：顶端胞质）良性增生上皮：顶端胞质+l （3）前列腺癌（除外分化最差的）均阳性）前列腺癌（除外分化最差的）均阳性l 分化越高，阳性越强分化越高，阳性越强l （4）偶尔前列腺以以外组织局灶弱）偶尔前列腺以以外组织局灶弱+（多为尿路的腺上（多为尿路的腺上皮及其癌；唾液腺、乳腺癌等）尿路上皮皮及其癌；唾液腺、乳腺癌等）尿路上皮l2、高分子量角蛋白、高分子量角蛋白34 12（浆（浆+）l CK5/6（浆（浆+）l P63（核（核+）l能区分良恶性能区分良恶性:增生增生良性良性 PIN：基底细胞（浆：基底细胞（浆+）l 癌：癌：l能帮助区分良恶性能帮助区分良恶性l -甲基酰基辅酶消旋酶（甲基酰基辅酶消旋

30、酶（P504s）（浆（浆+）l 癌：敏感性、特异性表达约癌：敏感性、特异性表达约80100l 正常（偶尔腔面正常（偶尔腔面+）萎缩型腺体萎缩型腺体结节性增生（结节性增生（12%+）非典型性腺瘤性增生（非典型性腺瘤性增生（AAH）（）（17%+）高级高级别别PIN（90%+）l 前列腺间质的平滑肌、尿路上皮癌、肾细胞癌、及结前列腺间质的平滑肌、尿路上皮癌、肾细胞癌、及结肠癌也可肠癌也可+IGCNU 精原细胞精原细胞瘤瘤胚胎性癌胚胎性癌卵黄囊瘤卵黄囊瘤混合型生殖混合型生殖细胞肿瘤细胞肿瘤间质细胞瘤间质细胞瘤支持细胞瘤支持细胞瘤PLAP+弥弥+AFP+弥弥+HCG+HPL 可可+inhibin合体合

31、体+弥弥+弥弥CD117+弥弥CD99Vimentin+CD30+弥弥 MelanA神经内分泌神经内分泌+CK广广+8+18+高高广广+弥弥19+弥弥+/_+E M A CEA/合体合体+/合体合体+/合体合体+/合体合体+/合体合体+l3、子宫内膜间质肿瘤、子宫内膜间质肿瘤 平滑肌肿瘤平滑肌肿瘤 l SMA +l SMSA +l Desmin -+l H-caldesmin -+特异特异l CD10 +-l4、平滑肌瘤平滑肌瘤 平滑肌肉瘤平滑肌肉瘤lER/PR +lBcl-2 +lP53 +lMIB-1 +l1、胎盘结节、滋养叶细胞肿瘤l Ki-67 -/少量+14%+/-7%l2、蜕膜组织

32、、滋养叶细胞lMEL-CAM -中间滋养+lPLAP -中间滋养+lCK -+lVIM +-lHCG -+lCD10 +-l3、女生女生 结肠结肠 肝细胞癌肝细胞癌 肺小细胞癌肺小细胞癌 肾癌肾癌 lCK7 +-CK20 -+-l 4、间皮 lMC+CR+CK5/6+ll起源于起源于Cajal细胞的前驱细胞，表达细胞的前驱细胞，表达KIT酪氨酸激酶受体酪氨酸激酶受体（CD117）,似平滑肌样肿瘤的胃肠道间叶性肿瘤。似平滑肌样肿瘤的胃肠道间叶性肿瘤。l形态多样：形态多样：l平滑肌分化：平滑肌分化：l 梭形细胞，胶原丰富，核旁空泡梭形细胞，胶原丰富，核旁空泡-似平滑肌瘤；似平滑肌瘤；l神经分化：核

33、灶性栅栏状排列神经分化：核灶性栅栏状排列-似神经鞘瘤；似神经鞘瘤；l 细胞增大，多角形，上皮样细胞增大，多角形，上皮样-似上皮样平滑肌似上皮样平滑肌l 瘤或肉瘤。瘤或肉瘤。l非平滑肌和神经非平滑肌和神经l免疫组化：免疫组化：lCD117膜、胞质或核旁阳性，膜、胞质或核旁阳性，DOG-1+，CD34阳性（阳性（70-80%），SMA阳性（阳性（30-40%）,Desmin阳性阳性,S-100 阳性阳性,NF可阳性可阳性,胃肠道间质瘤胃肠道间质瘤A 溃疡位于病变溃疡位于病变的上端的上端B 切面显示向管切面显示向管壁扩展。壁扩展。间质瘤间质瘤A 栅栏状核似神经鞘瘤栅栏状核似神经鞘瘤B 梭形细胞有明显

34、细胞梭形细胞有明显细胞浆空泡浆空泡C 上皮样型上皮样型恶性胃肠道间质瘤恶性胃肠道间质瘤A 肿瘤细胞围绕血肿瘤细胞围绕血管形成血管旁细胞管形成血管旁细胞套，外周为坏死套，外周为坏死B 可见数个核分裂。可见数个核分裂。胃肠间质瘤胃肠间质瘤A 瘤细胞间见嗜伊瘤细胞间见嗜伊红色胶原纤维团块红色胶原纤维团块B CD34强阳性强阳性胃肠间质瘤胃肠间质瘤A 上皮样型上皮样型B Vimentin阳性阳性l多数情况下，激酶基因突变是主要的致癌事件多数情况下，激酶基因突变是主要的致癌事件1,2KIT：80-85%1PDGFRA：72野生型（无法检测到的突变）：野生型（无法检测到的突变）：10-15%1 SDH-d

35、eficient GISTl 突变导致激活的酪氨酸激酶受体持续的异常表达突变导致激活的酪氨酸激酶受体持续的异常表达(KIT或或PDGFRA)3 Gain of function mutationPDGFRA，血小板源性生长因子受体，血小板源性生长因子受体；PDGFRA，血小板源性生长因子受体，血小板源性生长因子受体 基因基因1.Corless CL et al.J Clin Oncol.2004;22:3813-3825.2.Heinrich MC et al.Science.2003;299:708-710.3.Trent JC et al.Curr Opin Oncol.2006;18:3

36、86-395.KITExon 11Most common site of mutationExon 92nd most common site of mutationExons 13&17RarePDGFRAExons 12&14RareExon 183rd common site of mutation“Wild-type”Molecular etiology unclearFamilial GISTGermline KIT or PDGFRA mutation Carney-StratakisGermline mutations in SDH（A,B,C,D)PediatricKIT&PD

37、GFRA mutations are rareCarneys triadNo KIT or PDGFRA mutationsNF-1-relatedNo KIT or PDGFRA mutations胃肠道间叶来源的肿瘤胃肠道间叶来源的肿瘤CD117 CD117 免疫组化检测免疫组化检测GISTGIST是是desmindesmin检测阳性检测阳性平滑肌瘤平滑肌瘤是是否否S-100S-100检测阳性检测阳性神经鞘瘤神经鞘瘤是是DOG1 DOG1 检测检测GISTGIST是是否否野生型野生型GISTGIST其他肿瘤其他肿瘤KIT KIT 基因检测基因检测GISTGISTPDGFRPDGFR基因检测

38、基因检测否否GISTGIST是是是是是是否否GISTGIST诊断流程诊断流程-GSIT-GSIT 中国共识中国共识中国GIST诊断治疗专家共识2008l2、胃肠道间质瘤l CD117+（重要）、DOG-1（重要）、CD34+l Desmin+/、SMA/MSA+/l S-100+/、NF+/l P63+、P53+、Ki-67+预后差l3、Barrett食管l占GIST的5%7.5%l临床上常以综合征的形式表现 （如Carney三联征或Carney-Stratakis 综合征）l好发于胃，上皮样GIST，多结节性 淋巴管瘤栓，淋巴结转移l免疫组化:可表达CD117和DOG1，不表达SDHBlc-

39、kit或PDGFRA基因突变检测显示为野生型l核分裂象不能评估危险度，发生转移的间隙期较长，故需长期随访l+in 70%GISTs:47%in small intestine;96%in rectum;100%in esophoguslCD34 is not specific for GISTslCD34+:孤立性纤维性肿瘤（孤立性纤维性肿瘤（90%）,炎炎症性纤维性息肉、去分化脂肪肉瘤、皮症性纤维性息肉、去分化脂肪肉瘤、皮肤隆突性纤维肉瘤肤隆突性纤维肉瘤（90%）、某些神经肿瘤、卡波西肉瘤、）、某些神经肿瘤、卡波西肉瘤、多数血多数血 管肉瘤、许多上皮样肉瘤管肉瘤、许多上皮样肉瘤 免疫组化在肿

40、瘤研究中的应用免疫组化在肿瘤研究中的应用 1、提高病理诊断的准确性，确定肿瘤来源及类、提高病理诊断的准确性，确定肿瘤来源及类 型。型。通过检测细胞骨架抗原（如通过检测细胞骨架抗原（如CK,Vimetin,Desmin,GFAP等）等）;细胞功能产物抗原（如激素，细胞功能产物抗原（如激素，免疫球蛋白，免疫球蛋白，NSE,CgA等）等）;细胞表型标记物，细胞表型标记物，属细胞膜抗原（如属细胞膜抗原（如LCA,EMA)及各种淋巴细胞表及各种淋巴细胞表型）和胚胎期抗原（如型）和胚胎期抗原（如CEA,AFP).确定肿瘤来源确定肿瘤来源 2、某些激素受体及生长因子的检测可判断预后。、某些激素受体及生长因子

41、的检测可判断预后。如：如：PR、ER、免疫组化在肿瘤研究中的应用免疫组化在肿瘤研究中的应用 3、癌基因蛋白的研究，研究肿瘤的发生、发展、癌基因蛋白的研究，研究肿瘤的发生、发展 过程，如各种癌基因、抑癌基因及其相关过程，如各种癌基因、抑癌基因及其相关因素。P53:恶变恶变 Bcl-2：淋巴结生发中心反应性和淋巴瘤的区别：淋巴结生发中心反应性和淋巴瘤的区别 Cer-b-B-2：乳腺导管内上皮的重度非典型增生和乳腺导管内上皮的重度非典型增生和 乳腺导管内癌的区别乳腺导管内癌的区别 4、评价肿瘤增殖活性，对肿瘤分化、复发、评价肿瘤增殖活性，对肿瘤分化、复发 提供参考。如提供参考。如ki-67,PCNA

42、等。等。5、检测肿瘤组织的转移潜能，如、检测肿瘤组织的转移潜能，如nm23-H,CD44V6,MMP等。等。6、协助判定肿瘤的分期、协助判定肿瘤的分期 LN和和型可显示有无浸润型可显示有无浸润7、提高微小癌灶的发现率、提高微小癌灶的发现率8、指导肿瘤的治疗、指导肿瘤的治疗 PR、ER、Cer-b-B-2和许多耐药基因的检测和许多耐药基因的检测9、免疫性疾病的辅助诊断、免疫性疾病的辅助诊断10、病原生物的检查、病原生物的检查 如：如：HPV、EB、HP等等 l 免疫组化染色的注意事项免疫组化染色的注意事项：l（一）抗体的保存和配制（一）抗体的保存和配制l1、保存：、保存：l 浓缩抗体：浓缩抗体：

43、-20-40C 约约12年年l 即用型抗体；即用型抗体；4C 约约1年年l2、抗体的配制：、抗体的配制：l 浓缩抗体必须找抗体的最佳稀释度浓缩抗体必须找抗体的最佳稀释度l 即用型抗体直接使用即用型抗体直接使用l（二）正确设计对照（二）正确设计对照l 阴性对照（阴性对照（PBS或非免疫血清）、阳或非免疫血清）、阳性对照（购置的或自己收集的）、自身对照性对照（购置的或自己收集的）、自身对照、l抑制对照和吸收对照。抑制对照和吸收对照。l 抑制对照和吸收对照一般不用。抑制对照和吸收对照一般不用。l（三）出现假阳性的几种常见原因（三）出现假阳性的几种常见原因l1、抗体稀释度不够，浓度太高。、抗体稀释度不

44、够，浓度太高。l2、抗体与多种抗原有交叉反应。、抗体与多种抗原有交叉反应。l3、抗体与组织中某些成分非特异性结合，、抗体与组织中某些成分非特异性结合，l 出现异常表达，如：出现异常表达，如：S-100在鳞状上皮表达。在鳞状上皮表达。l4、内源性酶的显色、内源性酶的显色l5、肿瘤与病变组织中有其他组织残留、肿瘤与病变组织中有其他组织残留l （尤其是肿瘤中有正常组织残留）（尤其是肿瘤中有正常组织残留）l6、抗原的弥散或被瘤细胞吞噬而使抗原、抗原的弥散或被瘤细胞吞噬而使抗原l 在不该出现的部位出现。在不该出现的部位出现。l7、异位抗原的表达，（有人认为是交叉、异位抗原的表达，（有人认为是交叉l 免疫

45、反应）免疫反应）l8、内源性生物素的影响。、内源性生物素的影响。表2：生物素在正常组织中的分布情况组织生物素组织生物素组织生物素舌鳞状上皮-喉黏膜腺管+/1卵巢间质-舌横纹肌-支气管上皮+/3卵巢颗粒细胞+/2食道鳞状上皮-支气管腺体+/2乳腺小叶、导管+/3胃上皮-肺泡-乳头鳞状上皮-胃腺体+/3肾脏近曲管+/3脑胶质-十二指肠平滑肌-肾脏远曲管+/3神经元+/312指肠上皮腺体+/3肾小球-神经纤维-小肠上皮+/2肾集合管+/3甲状腺腺泡+/2小肠上皮、腺体+/2肾盂移行上皮+/3甲状腺C细胞+/3阑尾上皮、腺体+/3膀胱+/2甲旁腺嗜酸细胞+/3结肠上皮、腺体+/3前列腺+/3肾上腺皮质

46、+/3直肠上皮、腺体+/3尿道上皮+/3肾上腺髓质-肛门鳞状上皮-睾丸曲细精管+/3胃内分泌细胞+/3腮腺导管+/3附睾支持细胞+/2睾丸间质细胞+/3腮腺腺泡-输精管上皮+/2胰岛-颌下腺导管+/3宫颈鳞状上皮-淋巴结-颌下腺腺泡-宫颈柱状上皮-扁桃体-胰腺腺泡-宫颈腺上皮+/2脾-胰腺导管+/3增殖期内膜腺体+/2浆细胞+/3肝细胞+/3分泌期内膜腺体+/3皮肤鳞状上皮底层+/3胆管+/2蜕膜腺体+/2皮脂腺+/3胆囊+/3蜕膜细胞+/3脂肪细胞+/3鼻黏膜上皮+/2胎盘绒毛+/2平滑肌-鼻黏膜腺体+/2脐带-横纹肌-会厌黏膜-输卵管+/1心肌+/3 血管-注：-阴性；+/1 弱阳性点状分

47、布；+/2 中度阳性片状分布；+/3 强阳性弥漫分布。HE未修复未修复修复修复修复修复+封闭封闭修复修复+DAB标准标准CK生物素生物素生物素生物素标准标准CK生物素生物素+CK胃内分泌细胞胃内分泌细胞皮脂腺皮脂腺垂体腺瘤垂体腺瘤腺淋巴瘤腺淋巴瘤大鼠肾脏大鼠肾脏大鼠肝脏大鼠肝脏大鼠胰腺大鼠胰腺（1）冰冻组织中存在内源性生物素。）冰冻组织中存在内源性生物素。（2）经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭。）经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭。（3）加热抗原修复可造成内源性生物素暴露。）加热抗原修复可造成内源性生物素暴露。（4）内源性生物素暴露的强度各不相同，从弱阳性（）内源性生物素暴露的强度各不相同，

48、从弱阳性（+）到强阳性（到强阳性（+）。）。（5）内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布）内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布 也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中。也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中。（6）内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺）内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺 上皮组织，亦存在部分非上皮组织。上皮组织，亦存在部分非上皮组织。（7）内源性生物素不仅存在人体组织，也存在大鼠组织。）内源性生物素不仅存在人体组织，也存在大鼠组织。（8）内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增）内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增 加依次为：

49、柠檬酸、加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA。（9）热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭。）热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭。为了避免免疫组化中内源性生物素的干扰，凡采用冰为了避免免疫组化中内源性生物素的干扰，凡采用冰冻切片或石蜡切片加热抗原修复用非生物素检测系统：冻切片或石蜡切片加热抗原修复用非生物素检测系统：1、进行内源性生物素封闭，并成为常规。可采用蛋清或、进行内源性生物素封闭，并成为常规。可采用蛋清或 卵白素作为封闭剂。卵白素作为封闭剂。2、或采用非生物素检测系统，如、或采用非生物素检测系统，如EnVision等。等。3、应坚持使用阴性对照。、应坚持使用阴性对照。l（四

50、）出现假阴性的几常见种原因（四）出现假阴性的几常见种原因l1、抗体和检测试剂盒配对不合理（现在一、抗体和检测试剂盒配对不合理（现在一l 般用通用型可避免试剂盒配对不合理）般用通用型可避免试剂盒配对不合理）l2、抗体的浓度太低、抗体的浓度太低l3、孵育的时间太短（根据要求做）、孵育的时间太短（根据要求做）l4、固定和温度、固定和温度l 有的抗体不适合用于福尔马林固定的组有的抗体不适合用于福尔马林固定的组织，仅适合用于冰冻切片；固定、包埋的温织，仅适合用于冰冻切片；固定、包埋的温度过高，抗原丢失（度过高，抗原丢失（62C）l5、染色步骤不正确、染色步骤不正确l6、染色过程中切片过分干燥、染色过程中