化学发光原理及应用课件.pptx

1、化学发光原理及应用化学发光原理及应用主要内容主要内容化学发光基本原理化学发光分析方法常见化学发光体系及其分析应用Part I.化学发光基本原理化学发光基本原理 某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生的化学能化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光化学发光(chemiluminescence)。化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光生物发光(bioluminescence)。化学化学反应反应-G化学发化学发光光h 入射光入射光h 1荧光荧光h 2磷光磷光h 3化学发光包含化学反应、能量传递以及后续激发态弛

2、豫(与荧光一致)三个过程2.化学发光光谱化学发光光谱化学发光光谱与发光体的荧光发射光谱具有对应关系化学发光光谱与发光体的荧光发射光谱具有对应关系能量，通道，荧光物质能量，通道，荧光物质*9,10-二苯基蒽二苯基蒽,将将200Hz 左右的方波电位左右的方波电位(+1.3 -2.2V vs.SCE)加到电极加到电极 DPA-e DPA.+(+1.3 V)DPA+e DPA.-(-2.2 V)DPA.+DPA.-1DPA*+DPA 1DPA*DPA+h (=512nm)+1.3 V-2.2 V灵敏度高，响应的物种数多，但是选择性灵敏度高，响应的物种数多，但是选择性差差使R过量CA(t)=CA0 e-

3、ktIcl(t)=cl V =cl kCA(t)=cl kCA0 e-k t尽管A物质的 CA0 各不相同,但 I 达到 Imax的时间相同.e-kt为常数.Icl(t)CA0 定量分析的依据定量分析的依据dcAdtkRAV=任何对此过程产生影响的物质浓任何对此过程产生影响的物质浓度都可能用化学发光法测定度都可能用化学发光法测定一、化学发光分析法原理一、化学发光分析法原理二、化学发光分析法流路二、化学发光分析法流路 1.分立式进样化学发光仪分立式进样化学发光仪PMTR1R2s这类仪器适合于选择性好,量子效率高或发光体寿命长的化学发光反应的监测。不适用于快速化学发光反应(15S)的重现性监测。暗

4、室 2.流动注射进样化学发光仪流动注射进样化学发光仪几乎适用于所有 15s的快速化学发光反应并且可以增加合适的延迟流路或采用停流技术以适应长寿命的化学发光反应，所得的化学发光强度可以随时间积累样品samplewastePMTrecorder蠕动泵流通池(flow cell)试 剂 瓶暗室3.HPLC-CL联用联用技术技术流动相A流动相B高压泵高压泵混合器进样阀色谱柱试剂1试剂2混合器混合反应DAD检测器废液滤光片流动池光电倍增管记录将化学发光高灵敏度的特点与HPLC高分离效率的优势结合，可以应用于复杂体系中多种痕量物质的定量分析，一般不需要复杂的衍生过程暗室 鲁米诺化学发光体系鲁米诺化学发光体

5、系 吖啶酯类化学发光体系吖啶酯类化学发光体系 过氧化草酸酯类化学发光体系过氧化草酸酯类化学发光体系 无机物化学发光体系无机物化学发光体系碱性高碘酸钾碱性高碘酸钾酸性高锰酸钾酸性高锰酸钾酸性硫酸铈酸性硫酸铈稀土配合物稀土配合物(中性中性)其他化学发光体系其他化学发光体系量子产率：0.150.05氧化剂:H2O2 O2 KMnO4 NaClO I2 Fe(CN)63-.催化剂:过氧化酶 氧化血红素 过渡金属离子(Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+etc.)间接测定：在生物酶作用下与O2生成H2O2的葡萄糖和氨基酸以及相应的酶OXIDANT

6、BASEluminol*3-Aminophthalate+h3-APAmax=425 nm2.邻菲罗林邻菲罗林(1,10-phenanthroline)氧化剂:H2O2 催化剂:Cu2+Co2+Pb2+Fe3+Ni2+抑制剂:蛋白质与Cu2+形成络合物 代表性物质：光泽精代表性物质：光泽精(lucigenin)氧化剂：H2O2；还原剂+O2 还原剂：乳酸 尿酸 抗坏血酸催化剂：过渡金属离子、酶抑制剂：酚类物质对此反应有抑制作用间接测定：能够生成H2O2的基质及相应的酶max=445 nm量子产率高，易于标记，是量子产率高，易于标记，是发展化学发光免疫分析和发展化学发光免疫分析和DNA发光探针的

7、重要标记物发光探针的重要标记物氧化剂：H2O2背景发光：max=440 nm,550nm发射波长：取决于共存荧光物质q 氧分子对的发射：氧分子对的发射：490 500 nmq CO2双分子发射：双分子发射：430 450 nm林金明 Analytical Chemistry 2002多酚类物质对该体系的化学发光有增强作用多酚类物质对该体系的化学发光有增强作用1.KMnO4 还原剂还原剂 CL体系体系KMnO4+Red Intermediate(激发态)直接CL Fluorophore Fluorophore(激发态)间接CL还原剂：氨基酸、SO2、碘、药物、毒品等具有还原性的物质量子产率不高，

8、可以加入强还量子产率不高，可以加入强还原性物质增强体系灵敏度原性物质增强体系灵敏度可以测定化学需氧量 Talanta 2003,61,651-6581.高价铈高价铈 CL体系体系Chemiluminescence of Ce(IV)and surfactant Tween 20 Analyst,2001,126,553一些多酚类和胺类物质对该体系有增强和抑制作用一些多酚类和胺类物质对该体系有增强和抑制作用Organic Compounds*Organic Compounds*Salicylic acid+773Chlorogenic acid+31Sulphosalicylic acid+79

9、7Ascorbic acid+282,4-Dihydroxybenzoic acid+5572,4-Dinitrophenol*Phloroglucinol+408Benzoic acid*m-Nitrophenol+326Tannic acid-88Resorcinol+296Gallic acid-91p-Hydroxybenzoic acid+2764-t-Butylpyrocatechol-92o-Nitrophenol+115Pyrogallol-127Phenol+96Dopamine-42Rutin+80Aniline*Catechol+73p-Phenylendiamine*3

10、,4-Dihydroxybenzoic acid+69 2.气相气相 CL体系体系 Journal of Chromatography A,842(1999)267308 以以N的氧化物为例的氧化物为例 450C(Catalyst)q 臭氧法测定臭氧法测定N的氧化物的氧化物能够与臭氧反应产生化学发光的物质：能够与臭氧反应产生化学发光的物质：不饱和脂肪烃和芳香族化合物；含有N，S等杂原子的化合物；卤代有机酸和卤代烷烃；N的氧化物和CO；金属有机化合物；细菌。3.萤火虫发光萤火虫发光(firefly BL)max=562 nm此反应重要的分析对象是ATP 10-1110-14mol4.细菌发光细菌发光(bacterial BL)还原型吡啶核苷酸黄素主要分析物 FMN 10-12mol此反应常用于NADH和NADPH试验 10-15molmax=490nm5.化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析仪化学发光免疫分析仪局限性：局限性：方法选择性较差、发光体系相对较少、仪方法选择性较差、发光体系相对较少、仪器商品化不够器商品化不够