固定化酶及固定化菌体课件.ppt

1、跳转到第一页第二讲第二讲 固定化酶和固定化菌体固定化酶和固定化菌体 第一节第一节 微生物酶微生物酶第二节第二节 酶的特性酶的特性第三节第三节 固定化酶固定化酶第四节第四节 固定化菌体固定化菌体跳转到第一页第一节第一节 微生物酶微生物酶一一 生物催化剂生物催化剂酶酶二二 微生物酶的优越性微生物酶的优越性三三 菌体内酶与菌体外酶菌体内酶与菌体外酶本节内容本节内容：跳转到第一页一一 生物催化剂生物催化剂酶酶 微生物酶微生物酶：微生物生活细胞产生的具有催化作：微生物生活细胞产生的具有催化作用和专一激活能力的蛋白质。用和专一激活能力的蛋白质。在常温、常压下对复杂的生物化学反应在常温、常压下对复杂的生物化

2、学反应 有特异的催化作用。在物理化学条件下有特异的催化作用。在物理化学条件下 不稳定。可通过改变物理、化学条件控不稳定。可通过改变物理、化学条件控 制酶的反应。制酶的反应。在发酵过程中就是利用微生物的酶系统调节在发酵过程中就是利用微生物的酶系统调节代谢和控制生产。代谢和控制生产。跳转到第一页二二 微生物酶的优越性微生物酶的优越性1 1 酶的来源：动物、植物、微生物。酶的来源：动物、植物、微生物。（1 1）微生物生长速度快，易于大量培养。）微生物生长速度快，易于大量培养。（2 2）通过菌种选育改进培养条件，便于人为提高）通过菌种选育改进培养条件，便于人为提高产量。产量。（3 3）菌种不同，产生酶

3、的种类有差异。）菌种不同，产生酶的种类有差异。（4 4）利用微生物酶反应，以活菌体进行催化，简）利用微生物酶反应，以活菌体进行催化，简化工艺，缩短反应周期。化工艺，缩短反应周期。（5 5）产量高、成本低、不受季节限制，便于工业）产量高、成本低、不受季节限制，便于工业化生产。化生产。2 2 微生物酶的优越性微生物酶的优越性跳转到第一页三三 菌体内酶与菌体外酶菌体内酶与菌体外酶1 1 菌体内酶菌体内酶 产生的酶分布在微生物细胞内，又叫产生的酶分布在微生物细胞内，又叫胞内酶胞内酶。胞内酶的使用胞内酶的使用：（1 1）把酶从菌体细胞内抽提出来。繁杂、易）把酶从菌体细胞内抽提出来。繁杂、易失活失活（2

4、2）固定化细胞。用一定的方法将微生物菌）固定化细胞。用一定的方法将微生物菌体固定在载体上制成体固定在载体上制成固定化菌体固定化菌体。简单、利用。简单、利用率高、不易失活。率高、不易失活。如：如：大肠杆菌大肠杆菌产生的产生的青霉素酰胺酶青霉素酰胺酶的利的利用。用。跳转到第一页 2 菌体外酶菌体外酶产生的酶分泌到菌体外，又叫产生的酶分泌到菌体外，又叫胞外酶胞外酶。胞外酶的使用胞外酶的使用：（1 1）除去菌体，把含酶的培养滤液直接用于）除去菌体，把含酶的培养滤液直接用于生物催化反应。生物催化反应。（2 2）把酶抽提出来用一定的方法制成）把酶抽提出来用一定的方法制成“固定固定化酶化酶”。如：如：葡萄糖

5、淀粉酶葡萄糖淀粉酶与与羧甲基纤维素羧甲基纤维素（CMCCMC）离离子结合制成的子结合制成的固定化酶固定化酶跳转到第一页第二节第二节 酶的特性酶的特性一一 酶的催化性酶的催化性二二 酶的专一性酶的专一性三三 影响酶反应速度的因素影响酶反应速度的因素跳转到第一页一一 酶的催化性酶的催化性A+B C+DA+B C+D酶反应酶反应enzymetic resctionenzymetic resction酶酶底物底物：接收酶催化的化学反应的物质。：接收酶催化的化学反应的物质。A A、B B酶的催化性酶的催化性：改变底物原子排列并增进反应速度的功能改变底物原子排列并增进反应速度的功能微生物酶的催化性是在常温

6、、常压下起作用微生物酶的催化性是在常温、常压下起作用的的跳转到第一页二二 酶的专一性酶的专一性v绝对专一性绝对专一性：一定的酶只能作用于一定的底物。酶对底：一定的酶只能作用于一定的底物。酶对底 物有很强的选择性。能从多种复杂的底物物有很强的选择性。能从多种复杂的底物 混合物中与特定底物反应。如：脲酶只能混合物中与特定底物反应。如：脲酶只能 作用于尿素。作用于尿素。v相对专一性相对专一性：一种酶除能与特定底物作用外，也能与同底：一种酶除能与特定底物作用外，也能与同底 物化学结构相类似的底物起作用。物化学结构相类似的底物起作用。酶对底物的选择性较低。如：酶对底物的选择性较低。如：D D氨基酸氧化氨

7、基酸氧化 酶能催化多种酶能催化多种D D氨基酸脱氨。氨基酸脱氨。v立体异构专一性立体异构专一性：一种酶只能作用于旋光异构体的一种：一种酶只能作用于旋光异构体的一种 或顺反异构体的一种。如：或顺反异构体的一种。如：L L乳酸乳酸 脱氢酶只能作用于脱氢酶只能作用于L L乳酸。反丁烯乳酸。反丁烯 二酸酶只能作用于分丁烯二酸。二酸酶只能作用于分丁烯二酸。跳转到第一页三三 影响酶反应速度的因素影响酶反应速度的因素最适反应温度最适反应温度：能形成：能形成最大反应速度最大反应速度的温的温 度度.在适温范围内，随温度在适温范围内，随温度 上升，反应速度上升。温上升，反应速度上升。温 度每增高度每增高1010，

8、速度提高，速度提高 1 12 2倍倍受温度、氢离子浓度、酶浓度、底物浓度等因素影响。受温度、氢离子浓度、酶浓度、底物浓度等因素影响。1 1 温度温度微生物体内微生物体内303060601 1 B-B-半乳糖苷酶半乳糖苷酶2 2 酰化氨基酸水解酶酰化氨基酸水解酶3 3 葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶跳转到第一页2 氢离子浓度氢离子浓度酶蛋白是两性电解质酶蛋白是两性电解质。酶活性在特定的电荷状态下发挥。酶活性在特定的电荷状态下发挥。酸性系统酸性系统，越倾向于酸，正电荷越多。，越倾向于酸，正电荷越多。碱性系统碱性系统，越倾向于碱，负电荷越多。，越倾向于碱，负电荷越多。酸碱都会降低酶活酸碱都会降低酶活甚至失

9、活。甚至失活。最适最适PHPH值值：能保持最大：能保持最大 酶活性的酶活性的PHPH 值值 约在约在5 5 10 10。中性居。中性居 多。多。跳转到第一页3 3 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响 底物充足、条件适合，酶反应速度与酶浓度成正比。底物充足、条件适合，酶反应速度与酶浓度成正比。4 4 底物浓度对反应速度的影响底物浓度对反应速度的影响米门公式：米门公式：V=V=V V最大最大S SK Km m+S+S V V：反应速度反应速度 V V最大最大:最大反应速度最大反应速度 Km:Km:米氏常数米氏常数 S S：底物浓度底物浓度（1 1）当当Km=SKm=S时，时，V=V=（2

10、 2）S S Km Km时，时，V=VV=V与与S S成正比。一级反应成正比。一级反应（3 3）S S KmKm时，时，V=VV=V最大最大 V V与与S S无关。无关。零级反应零级反应V V最大最大2 2V V最大最大S SKmKm跳转到第一页米门公式图示米门公式图示跳转到第一页纵上所述，直接利用微生物酶纵上所述，直接利用微生物酶（1 1）不稳定不稳定。在高温、高压、强酸、强碱下。在高温、高压、强酸、强碱下。（2 2）易失活易失活。即使在最适合的条件下反应。即使在最适合的条件下反应。（3 3）回收困难回收困难。用适当方法提取目的产物后，残存酶回。用适当方法提取目的产物后，残存酶回 收困难。收

11、困难。（4 4）反应速度减慢。反应速度减慢。随着反应时间的推移。随着反应时间的推移。（5 5）经济上不合算。经济上不合算。一次性反应后不能再次使用。一次性反应后不能再次使用。阻碍了微生物酶的应用和发展。阻碍了微生物酶的应用和发展。研制固定化酶和固定化菌体研制固定化酶和固定化菌体跳转到第一页第三节第三节 固定化酶固定化酶一一 固定化酶的源流固定化酶的源流二二 酶固定化后的性质变化酶固定化后的性质变化三三 固定化酶的形态和作用模型固定化酶的形态和作用模型四四 酶的固定化方法举例酶的固定化方法举例五五 制备和应用固定化酶需注意的几个方面制备和应用固定化酶需注意的几个方面跳转到第一页固定化酶固定化酶i

12、mmobilized enzymeimmobilized enzyme是是19711971年年在美国举行在美国举行的第一次世界酶会议上推荐确定的。又称的第一次世界酶会议上推荐确定的。又称水不溶性水不溶性酶、固相酶。酶、固相酶。固定化酶固定化酶：水溶性酶通过物理和化学的方法，使之：水溶性酶通过物理和化学的方法，使之与不溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。与不溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。5050年代开始。将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，再与羧年代开始。将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，再与羧 肽酸、淀粉酶等结合制成最早的固定肽酸、淀粉酶等结合制成最早的固定 化酶化酶19691969年。年。用固定化氨基酰

13、化酶拆分用固定化氨基酰化酶拆分DL-DL-氨基酸氨基酸 。第一个工业生产的固定化酶。第一个工业生产的固定化酶。跳转到第一页什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体固定化技术固定化技术水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）跳转到第一页一一 固定化酶的源流固定化酶的源流跳转到第一页固定化酶的优缺点固定化酶:固定化酶的研究已取得大量重要成果发挥着巨大作用，受到人们极大的关注。其重要原因是它和水溶性酶比较具有以下优点：(1)极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺残留，简化了提纯工艺.

14、(2)可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。化。(3)酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。(4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。(5)较能适应于多酶反应。较能适应于多酶反应。(6)酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。本低。跳转到第一页 固定化酶也存在一些缺点：(1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。(2)比较适应水溶性底

15、物和小分子底物。(3)与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后才能固定化。跳转到第一页二二 酶固定化后的性质变化酶固定化后的性质变化酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。1 1 对底物的特异性对底物的特异性。尤其注意立体结构对催化底物特异。尤其注意立体结构对催化底物特异性的影响。性的影响。2 2 酶反应最适酶反应最适PHPH值的改变值的改变。酶固定化后，酶蛋白质的电。酶固定化后，酶蛋白质的电子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。但有规子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。但有规律，可调整固定化方法，获得

16、最适合的反应条件。律，可调整固定化方法，获得最适合的反应条件。3 3 动力学常数的改变动力学常数的改变。米氏常数和最大反应速度会改变。米氏常数和最大反应速度会改变4 4 酶反应温度的改变酶反应温度的改变5 5 增加酶的稳定性增加酶的稳定性。对热、。对热、PHPH值、有机溶媒、蛋白质变值、有机溶媒、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。连续化反应稳定性连续化反应稳定性好。好。固定化酶的最大好处固定化酶的最大好处跳转到第一页三三 固定化酶的形态和作用模型固定化酶的形态和作用模型1 1 制备固定化酶的方法制备固定化酶的方法2 2 固定化酶的形态结构模型固定化酶的形态

17、结构模型3 3 固定化酶的作用模型及其反应机理固定化酶的作用模型及其反应机理跳转到第一页1 1 制备固定化酶的方法制备固定化酶的方法化学方法、物理方法、物理与化学结合法三种化学方法、物理方法、物理与化学结合法三种。制备时应注意制备时应注意：（1 1）保护酶蛋白的立体结构不变。）保护酶蛋白的立体结构不变。（2 2）避免不溶性载体与酶的活性中心发生作用）避免不溶性载体与酶的活性中心发生作用（3 3）在温和条件下进行，避免高温、高压、强酸碱等）在温和条件下进行，避免高温、高压、强酸碱等跳转到第一页（1 1）化学方法化学方法制备的固定化酶的形态结构模型制备的固定化酶的形态结构模型1 1 离子结合法离子

18、结合法2 2 交联法交联法3 3 载体结合法载体结合法4 4 架桥法架桥法5 5 网络结合网络结合6 6 酶网酶网共价键结合法共价键结合法1 12 23 34 45 56 62 2 固定化酶的形态结构模型固定化酶的形态结构模型跳转到第一页（2 2）物理方法物理方法制备的固定化制备的固定化酶的形态结构酶的形态结构模型模型1 1 物理吸附法物理吸附法2 2 包埋法包埋法3 3 微型胶囊法微型胶囊法4 4 凝胶格子型凝胶格子型5 5 空心纤维型空心纤维型6 6 纤维丝型纤维丝型1 12 23 34 45 56 6跳转到第一页（3 3）物理化学结合法物理化学结合法制备的固定化酶的形态结构模型制备的固定

19、化酶的形态结构模型1 1 架桥、包埋结合法；架桥、包埋结合法；2 2 包埋与离子结合法；包埋与离子结合法；3 3 共价结合包埋法共价结合包埋法1 12 23 3跳转到第一页3 3 固定化酶的作用模型及其反应机理固定化酶的作用模型及其反应机理（1 1）作用模型）作用模型可以连续进行催化可以连续进行催化反应（适宜的底物反应（适宜的底物浓度、温度、浓度、温度、pHpH值值）以以羧甲基纤维素羧甲基纤维素固定固定葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶水解水解淀淀粉生产葡萄糖粉生产葡萄糖为例说为例说明。明。跳转到第一页（2 2）反应机理）反应机理载体的作用载体的作用：保持酶的立体结构保持酶的立体结构 保护酶的活性中心保

20、护酶的活性中心 保证酶的连续催化反应保证酶的连续催化反应跳转到第一页四四 酶的固定化方法举例酶的固定化方法举例（一）一）载体结合法制备固定化酶载体结合法制备固定化酶（二）（二）包埋法制备固定化酶包埋法制备固定化酶（三）（三）交联法制备固定化酶交联法制备固定化酶（四）（四）固定化酶的制法及其特性比较固定化酶的制法及其特性比较跳转到第一页（一）载体结合法制备固定化酶（一）载体结合法制备固定化酶1 1 常用载体常用载体 粒子大小、网目结构表面积大小、亲水性部分粒子大小、网目结构表面积大小、亲水性部分的量、化学组成等方面考虑。的量、化学组成等方面考虑。纤维素、右旋糖酐、葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺纤维素、右

21、旋糖酐、葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃凝胶、多孔玻璃2 2 常用方法常用方法 按载体结合形式分为：按载体结合形式分为：共价键结合法共价键结合法 离子键结合法离子键结合法 物理吸附法物理吸附法跳转到第一页1.2.3 共价键结合法共价键结合法 共价键结合法是酶蛋白的侧链基团和载休表面上的共价键结合法是酶蛋白的侧链基团和载休表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法功能基团之间形成共价键而固定的方法。其优点是：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。(1)酶分子和载体连接的功能基团(2)在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是

22、酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性。跳转到第一页(2)载体的选择载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是:一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。性上都优于疏水载体。载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。载休没有或很少有非专一性吸附。载休没有或很少有非专一性吸附。载体来源容易方便并能反复使用。载体来源容易方便并能反复使用。跳转到第一页2 常用方法之一常用

23、方法之一共价键结合法共价键结合法 酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。即，通过固定化酶的方法。即，通过化学共价键化学共价键，把与，把与酶酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水连接在不溶于水的的载体载体上。上。（1 1）酶与载体反应的主要功能基团）酶与载体反应的主要功能基团游离羟基：肽链游离羟基：肽链C C末端的末端的 羧基，天门冬酰氨羧基，天门冬酰氨酸酸 ，谷氨酸的，谷氨酸的羧基羧基 游离氨基：肽链游离氨基：肽链N N末端的末端的 氨基，氨基，赖氨酸赖氨酸 氨基氨基巯基：半胱氨酸巯基：半胱氨酸羟基：丝氨酸

24、，苏氨酸羟基：丝氨酸，苏氨酸酚基：酪氨酸酚基：酪氨酸咪唑基：组氨酸咪唑基：组氨酸跳转到第一页2 常用方法之一常用方法之一共价键结合法共价键结合法（2 2）所用载体）所用载体重氮化法重氮化法：具有氨基的不溶性载体（：具有氨基的不溶性载体（R RNHNH2 2）。）。以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃烷烷 化化 法法：卤族的乙酰衍生物卤族的乙酰衍生物（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤 维素、碘乙酰纤维素）维素、碘乙酰纤维素）含卤族的高聚物含卤族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯

25、共聚物）（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）跳转到第一页2 常用方法之一常用方法之一共价键结合法共价键结合法（4 4）优缺点）优缺点优点优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长 时间使用。时间使用。缺点：缺点：制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏跳转到第一页1.2.1 吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。(1)物理吸附法:通过氢键、疏水作用和通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上从而制成固定化酶理作用，将酶固定于水不溶载体上从而制成固定化酶。常用的载体有：有机载体。纤维素、骨胶原

26、、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维索作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2。无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的r淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应半衰期分别为14、35、60d。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。跳转到第一页(2)离子交换吸附法:这是将酶与含有离予交换基的水不溶载将酶与含有离予交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，

27、在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)纤维素、DEAE葡聚糖凝胶、Amberlite IRA93、410、900等。阳离子交换剂基，如羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。此外，DEAE纤维素吸附的淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。跳转到第一页 通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷能通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解

28、吸。用水溶性乙烯顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE纤维素和DEAEScphadex载体有效的固定。这种固定几乎是不可逆的吸附。此外酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关。pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少，但也有个别例外。盐对吸附的影响较为复杂在一些特殊事例中、盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。对蛋对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。载体的表面积、多孔性及其顶处理都影响对酶的吸附。跳转到第一页 吸附法制备固定

29、化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用。但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性。跳转到第一页2 常用方法之二常用方法之二离子键结合法离子键结合法酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶（1 1）所用载体）所用载体纤维素的衍生物，离子交换树脂纤维素的衍生物，离子交换树脂（2 2）固定化酶的制备机理）固定化酶的制备机理酶蛋白的带电基团和含有

30、离子交换基团的固相载酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到离子交换剂上。离子交换剂上。（3 3）优缺点）优缺点优点优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构 和活性中心不易破坏，有利于制备高活性和活性中心不易破坏，有利于制备高活性 酶酶缺点缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下 酶易从载体上脱落酶易从载体上脱落跳转到第一页2 常用方法之三常用方法之三物理吸附法物理吸附法（1 1）常用载体）常用载体无机物无机物有机物有机物高分子化

31、合物高分子化合物活性炭、白陶土、活性炭、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶硅胶、碳酸钙凝胶淀粉麸质、大孔树脂、淀粉麸质、大孔树脂、DEAEDEAE纤维素、纤维素、DEAEDEAE葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（2 2）固定化酶的制备机理）固定化酶的制备机理所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。（3 3）优缺点）优缺点 优点优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的 高级结构高级结构;方法简单，成本低。方法简单，成本低。缺点缺点：酶吸附不牢固，易脱落；：酶吸附不牢固，易脱落；防止吸附酶的蛋白质与载体发

32、生变性反应防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应跳转到第一页物理吸附法固定化酶举例物理吸附法固定化酶举例载体载体固定化酶固定化酶活性炭活性炭 淀粉酶、淀粉酶、淀粉酶淀粉酶蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶多孔玻璃多孔玻璃核糖核酸酶、木瓜蛋白酶核糖核酸酶、木瓜蛋白酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶氧化铝氧化铝葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶碳酸钙凝胶碳酸钙凝胶亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶纤维素纤维素胰蛋白酶、核糖核酸酶胰蛋白酶、核糖核酸酶麸素麸素淀粉液化酶淀粉液化酶硅胶硅胶磷酸化酶磷酸化酶跳转到第一页（二）（二）包埋法制备固定化酶包埋法制备固定化酶 酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋

33、在酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。包埋方法有两种包埋方法有两种：1 1 格子型固定化酶格子型固定化酶2 2 微型胶囊法微型胶囊法跳转到第一页1 1 格子型固定化酶格子型固定化酶（1 1）原理）原理 以以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。反应为厌氧反应。网状格子中。反应为厌氧反应。跳转到第一页酶液酶液丙烯酰丙烯酰胺胺N N，N N双丙烯双丙烯酰胺酰胺氢气氢气催化

34、剂：四催化剂：四甲基乙二胺甲基乙二胺、明矾胺、明矾胺引聚剂：引聚剂：过硫酸钾、核黄素过硫酸钾、核黄素光照光照聚合反应聚合反应凝胶酶块凝胶酶块固定化固定化酶酶切切割割（2 2）方法（）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）跳转到第一页跳转到第一页凝胶或膜凝胶或膜酶酶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶、淀粉酶淀粉酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 淀粉淀粉胆碱酯酶胆碱酯酶琼脂琼脂青霉素酰胺酶青霉素酰胺酶（3 3）制备的固定化酶）制备的固定化酶跳转到第一页2 2 微型胶囊法微型胶囊法（1 1）原理）原理 把把酶包在酶包在超薄半透性超薄半透性的的聚合物膜聚合物膜中，

35、制成中，制成球状含酶球状含酶微型胶囊微型胶囊。跳转到第一页（2 2）特点）特点微囊直径几微米几百微米。微囊直径几微米几百微米。低分子底物低分子底物可以自由通过并可以自由通过并进入微囊进入微囊内。内。与酶反应后的与酶反应后的生成物被排除在微囊外生成物被排除在微囊外，酶本身酶本身是高分子物质不能通过微囊而是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内跳转到第一页表表面面聚聚合合法法以以亲水性单体亲水性单体和和疏水性单体疏水性单体在表面发生聚合反应将在表面发生聚合反应将酶包围起来，形成微型胶囊酶

36、。分酶包围起来，形成微型胶囊酶。分三三步：步：常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类亲水性单体亲水性单体疏水性单体疏水性单体生成的聚合物生成的聚合物聚胺聚胺聚异氰衍生物聚异氰衍生物聚胺、聚酯聚胺、聚酯乙二醇、多元醇乙二醇、多元醇聚异氰衍生物聚异氰衍生物聚胺、聚酯聚胺、聚酯（3 3）方法）方法 表面聚合法表面聚合法、液中干燥法、相分离法、液中干燥法、相分离法跳转到第一页A A 乳化分散乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。溶于水的有机溶媒中充分乳化。B B 表面聚合表面聚合：将含有疏水性单体的

37、有机溶媒加入到上：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。来形成微型胶囊球。三步三步：C C 清洗清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单体余单体1 1跳转到第一页（4 4）微型胶囊法形成的固定化酶）微型胶囊法形成的固定化酶胶囊制法胶囊制法囊膜的素材囊膜的素材应用的酶应用的酶表面聚合法表面聚合法尼龙尼龙乳糖酶乳糖酶羧基脱氢酶羧基脱氢酶聚合脲聚合脲天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶液中干燥法液中干燥法聚苯乙烯聚苯乙烯过氧化氢酶过氧化氢酶脂肪酶脂肪酶脲酶脲酶相分

38、离法相分离法火棉胶火棉胶过氧化氢酶过氧化氢酶天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶硝酸纤维素硝酸纤维素天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶跳转到第一页缺点缺点：单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防 治酶的失活和变性。治酶的失活和变性。优点优点：A A 制备条件温和，制得的胶囊不易变化。制备条件温和，制得的胶囊不易变化。B B 能很好地保存天然酶的活性和特性。能很好地保存天然酶的活性和特性。C C 大小可任意调节，制备时间短。大小可任意调节，制备时间短。（5 5）微型胶囊法优缺点）微型胶囊法优缺点跳转到第一页（三）（三）交联法制备固定化酶交联法制备固定化酶概念概念：双功能试剂或多功

39、能试剂双功能试剂或多功能试剂与酶蛋白质中的与酶蛋白质中的氨氨 基酸残基基酸残基作用，使酶与酶之间交联成作用，使酶与酶之间交联成网网，凝集成固定化酶凝集成固定化酶1 1 发生作用的氨基酸残基发生作用的氨基酸残基：酪氨酸的酚基酪氨酸的酚基 胱氨酸的胱氨酸的SHSH巯基巯基 N N末端的末端的a a氨基。氨基。2 2 常用的双功能或多功能试剂常用的双功能或多功能试剂：戊二醛戊二醛 聚甲叉双碘乙酰胺聚甲叉双碘乙酰胺 双重氮联苯胺双重氮联苯胺跳转到第一页3 3 酶网载体交联法酶网载体交联法 先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂 戊二醛戊二醛与与酶蛋白的

40、氨基酶蛋白的氨基之间之间交联交联起来，形成起来，形成酶网酶网包围在包围在 载体表面。载体表面。常用载体常用载体：硅胶、离子交换树脂。：硅胶、离子交换树脂。跳转到第一页（四）（四）固定化酶的制法及其特性比较固定化酶的制法及其特性比较 特性特性制备方法制备方法共价键共价键结合法结合法离子离子结合法结合法物理物理吸附法吸附法包埋法包埋法制法制法难难易易易易难难酶活力酶活力高高高高高高低低底物特异性底物特异性易变易变不变不变不变不变不变不变结合能力结合能力弱弱中中弱弱弱弱再生再生不可不可可能可能可能可能不可不可交联法交联法难难中中易变易变强强不可不可跳转到第一页五五 需注意的几个方面问题需注意的几个方

41、面问题（一（一）酶活性的测定方法酶活性的测定方法（二）（二）制备过程中保持酶活性稳定的方法制备过程中保持酶活性稳定的方法（三）（三）固定化酶的保存方法固定化酶的保存方法跳转到第一页（一）酶活性的测定方法（一）酶活性的测定方法1 1 测定酶的固定化量测定酶的固定化量 固定化反应完成后，以原始酶量减去洗涤液（反应液）固定化反应完成后，以原始酶量减去洗涤液（反应液）中残存的酶含量。中残存的酶含量。2 2 测定颗粒直径测定颗粒直径 固定化酶的粒径越小，酶活性越高。固定化酶的粒径越小，酶活性越高。固定化酶颗粒直径固定化酶颗粒直径 大小影响酶活性。大小影响酶活性。3 3 测定酶反应最适测定酶反应最适pHp

42、H值值 酶固定化后反应的最适酶固定化后反应的最适pHpH较原来的酶有所变化。较原来的酶有所变化。4 4 检查酶是否脱落检查酶是否脱落 测定酶活性后，滤除固定化酶，用离心所得的溶液再经测定酶活性后，滤除固定化酶，用离心所得的溶液再经 过适当保温检查是否还继续进行反应，过适当保温检查是否还继续进行反应，如果溶液中出现酶如果溶液中出现酶 反应，说明酶脱落。反应，说明酶脱落。跳转到第一页（二）制备过程中保持酶活性稳定的方法（二）制备过程中保持酶活性稳定的方法1 1 包埋法、聚丙烯酰胺凝胶法或微型胶囊法时，固定化包埋法、聚丙烯酰胺凝胶法或微型胶囊法时，固定化 反应时，反应时，预先用与酶有特异亲和力的底物

43、等，保护酶预先用与酶有特异亲和力的底物等，保护酶 的活性中心的活性中心，而后再进行固定化反应。，而后再进行固定化反应。2 2 以酶的前体状态进行固定化以酶的前体状态进行固定化，然后经过活化制备固定，然后经过活化制备固定 化酶。化酶。3 3 防止酶在催化反应中活性下降防止酶在催化反应中活性下降下降原因下降原因 （1 1）酶的变性酶的变性 （2 2）吸附了酶的抑制物质。吸附了酶的抑制物质。（3 3）被微生物污染被微生物污染 （4 4）酶脱落酶脱落 （5 5）载体崩溃或变形分解载体崩溃或变形分解 （6 6）操作失误操作失误跳转到第一页（三）固定化酶的保存方法（三）固定化酶的保存方法使用时固定化酶的保

44、存是一个很重要的环节。使用时固定化酶的保存是一个很重要的环节。1 1 真空冷冻干燥保存（长期保存）真空冷冻干燥保存（长期保存）2 2 低温保存低温保存 3 3 多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体 更适于长期保存。更适于长期保存。4 4 无机质载体中，以重氮结合法制备的固定化酶具无机质载体中，以重氮结合法制备的固定化酶具 有较好的保存性。有较好的保存性。跳转到第一页第四节第四节 固定化菌体固定化菌体固定化菌体概念固定化菌体概念：把菌体细胞中特定的：把菌体细胞中特定的酶不经过分离提纯酶不经过分离提纯 ，直接直接用适当的方法用适当的方法将菌体加以固定

45、将菌体加以固定 来催化各种特定的生物化学反应。来催化各种特定的生物化学反应。优点优点：不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，成：不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，成 本低本低与固定化酶比较与固定化酶比较制备方法制备方法：与固定化酶相同，有：与固定化酶相同，有包埋法、载体结合法包埋法、载体结合法 、交联法、热处理法、射线处理法、交联法、热处理法、射线处理法。其中其中包埋法是最理想的方法包埋法是最理想的方法。跳转到第一页n固定化细胞 固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的。它的优点如下:n(1)省去了酶的分离手续为多酶系统，无须省去了酶的分离手续为多酶系统，无须辅因子再生。辅因子再生。n(2

46、)细胞生长快、而且多、反应快。细胞生长快、而且多、反应快。n(3)可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边徘出发酵和提取前不用分离去细胞，能一边徘出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。n(4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。跳转到第一页n固定化细胞同时也存在些缺点：n (1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。n (2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，

47、同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。n (3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。跳转到第一页一一 包埋法包埋法1 1 原理原理 在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其 包进包进半透性的多聚物膜半透性的多聚物膜内。内。小分子的底物和产物均可小分子的底物和产物均可 自由出入自由出入，而，而菌体细胞却不会漏出菌体细胞却不会漏出。2 2 方法方法常用的包埋材料常用的包埋材料是：是：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例将菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚将

48、菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸胺和加速剂四甲基乙二胺，混匀后放置一定时间聚合胺和加速剂四甲基乙二胺，混匀后放置一定时间聚合。将得到的凝胶破碎即得到固定化细胞。收率达。将得到的凝胶破碎即得到固定化细胞。收率达72.572.5跳转到第一页二二 载体结合法（吸附法）载体结合法（吸附法）1 1 原理原理 微生物细胞表面带有微生物细胞表面带有电荷电荷，在适当的条件下可以，在适当的条件下可以 与载体的与载体的离子交换基团离子交换基团形成络合物形成络合物或或吸附在载体吸附在载体上。上。2 2 常用载体常

49、用载体离子交换纤维素。阴离子树脂、离子交换纤维素。阴离子树脂、DEAEDEAE纤维素。纤维素。3 3 优缺点优缺点 优点优点：方法简单、载体易于再生。：方法简单、载体易于再生。缺点缺点：结合力弱，菌体细胞易脱落。：结合力弱，菌体细胞易脱落。跳转到第一页动植物细胞固定化植物细胞固定化 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。80年代开始研究，目前一般采用吸附法和包埋法。跳转到第一页吸附法 吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内。或吸附于中空纤维外壁上。如将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间，培养液及O2在中空维管内流动，透过中空纤维管壁(具半透膜性)，传递给附着于外壁的

50、细胞，细胞代谢产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究，可连续使用1个多月。又如将洗净、灭茵后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一 段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖。包埋法 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。Brodelius等(1979)首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞、毛地黄细胞、海巴戟细胞。跳转到第一页动物细胞固定化 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩需要最温和的固定化方法。目前,动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。吸附法 由于大多数动物细胞属于