小鼠脑片免疫组织化学SABC法试验课件.ppt

1、 了解免疫组织化学实验原理，熟练了解免疫组织化学实验原理，熟练掌握实验操作步骤。掌握实验操作步骤。免疫组织化学技术免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）是指用免疫）是指用免疫学原理（从组织细胞水平进行抗原和抗体学原理（从组织细胞水平进行抗原和抗体结合），通过特异的抗原抗体反应标记上结合），通过特异的抗原抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。位抗原或抗体成分的方法。一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检测并显示出来。可以用免疫细胞化学方法检测并显

2、示出来。在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位半定量测定。行细胞原位半定量测定。一是特异性强一是特异性强，因为免疫学的基本原，因为免疫学的基本原理是抗原与抗体理是抗原与抗体“一对一一对一”的特异结的特异结合，所以免疫组织化学从理论上讲也合，所以免疫组织化学从理论上讲也是是“一对一一对一”的组织细胞中抗原的特的组织细胞中抗原的特定显示。定显示。如角蛋白如角蛋白(keratin)显示显示 上皮成分、上皮成分、LC

3、A显示淋巴细胞成分。只是当组织细胞显示淋巴细胞成分。只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。二是敏感性高二是敏感性高：由于：由于ABC法或法或SP法的法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化的方法越来越方便地应用使免疫组化的方法越来越方便地应用于常规诊断工作中。于常规诊断工作中。三是定位准确、形态与功能相结合三是定位准确、形态与功能相结合：虽然：虽然聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)方

4、法已经广泛地应用于方法已经广泛地应用于疾病疾病 的诊断，但由于不能在组织和细胞内的诊断，但由于不能在组织和细胞内进行明确的定位而限制了进行明确的定位而限制了PCR在病理组织在病理组织学上的应用。学上的应用。免疫组化则可在组织和细胞免疫组化则可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可以同时对中进行抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或不同抗原在同一组织或 细胞中进行定位观细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对于病理学研究的深入是十分有意研究，对于病理学研究的深入是十分有意义。义。镊子，剪刀，针管，输液管，蛙板等。1.载玻片准备

5、载玻片准备 将新载玻片置于洗涤剂中煮沸将新载玻片置于洗涤剂中煮沸30min，先，先后用清水和蒸馏水冲洗干净，晾干，放入后用清水和蒸馏水冲洗干净，晾干，放入浓硫酸浓硫酸-重铬酸钾洗液中浸泡重铬酸钾洗液中浸泡12小时，流水小时，流水冲洗后再用蒸馏水清洗，干燥，在冲洗后再用蒸馏水清洗，干燥，在95%的的酒精中浸泡酒精中浸泡24h，擦干。盖玻片直接泡酸，擦干。盖玻片直接泡酸，其余处理步骤同载玻片。处理后的载玻片其余处理步骤同载玻片。处理后的载玻片用稀释度为用稀释度为1：10的多聚赖氨酸（防脱片：的多聚赖氨酸（防脱片：能较好吸附细胞和组织能较好吸附细胞和组织）浸泡）浸泡5min，37烘干，密封后保存备用

6、。烘干，密封后保存备用。昆明品系小鼠，用昆明品系小鼠，用0.4%戊巴比妥钠行腹腔麻醉，戊巴比妥钠行腹腔麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，经左心室快速灌注迅速打开胸腔，暴露心脏，经左心室快速灌注37生理盐水及生理盐水及4、4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲的多聚甲醛磷酸盐缓冲液（液（PFA）各）各50ml，开颅取脑，后固定，开颅取脑，后固定2小时；小时；用用0.01M的的PBS冲洗脑中的残留固定液，重复冲洗脑中的残留固定液，重复6次，次，每次每次1h；再依次移入；再依次移入75%、80%、95%及及100%的梯度酒精中脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋后，的梯度酒精中脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋后，进行连续石蜡冠状

7、切片，片厚约进行连续石蜡冠状切片，片厚约5 m；37温水温水中漂片，然后将切片放入中漂片，然后将切片放入65恒温箱中烤片恒温箱中烤片2h或或37 过夜，以使切片紧密粘附。过夜，以使切片紧密粘附。3.1 石蜡切片脱蜡至水化石蜡切片脱蜡至水化：二甲苯：二甲苯I、二甲苯、二甲苯II各各5min（脱（脱蜡），蜡），100%乙醇乙醇2min，95%、80%乙醇各乙醇各1min（水（水化），蒸馏水化），蒸馏水2min。3.2 灭活内源性过氧化物酶灭活内源性过氧化物酶：切片入：切片入3%H2O2，室温浸泡，室温浸泡10min，。蒸馏水洗，。蒸馏水洗2次，每次次，每次5min。3.3 热修复抗原热修复抗原：切

8、片浸入枸橼酸盐缓冲液（：切片浸入枸橼酸盐缓冲液（PH=6.0）,水浴加热，水浴加热，92-9810min,电炉断电，再重复一次。室温电炉断电，再重复一次。室温下自然冷却。下自然冷却。0.02 MPBS（PH=7.4）洗）洗3次次,每次每次5min。3.4 封闭内源性生物素封闭内源性生物素（封闭是将不结合抗体的空白位置（封闭是将不结合抗体的空白位置加以封闭，以避免抗体的非特异性结合，得到最最佳的特加以封闭，以避免抗体的非特异性结合，得到最最佳的特异结合效果异结合效果）：滴加）：滴加5%BSA封闭液，室温下封闭液，室温下20min。甩。甩去多余液体，不洗。去多余液体，不洗。1、滴加稀释度为滴加稀释

9、度为1：100的兔多克隆抗体的兔多克隆抗体c-fos（一抗一抗）,4冰箱中孵育过夜。冰箱中孵育过夜。0.02 MPBS洗洗3 次，每次次，每次5min。2、滴加生物素标记的山羊抗兔滴加生物素标记的山羊抗兔IgG（二抗二抗），），37 恒温恒温箱中孵育箱中孵育30min。0.02M PBS洗洗3次次,每次每次5min。3、滴加、滴加SABC（三抗三抗），），37恒温箱中孵育恒温箱中孵育30min。0.02MPBS洗洗4次次,每次每次5min。4、DAB显色（暗室）：取显色（暗室）：取1ml蒸馏水，加入蒸馏水，加入A，B，C试试剂各一滴，混匀后加至切片。室温避光显色，显微镜下控剂各一滴，混匀后加至

10、切片。室温避光显色，显微镜下控制反应时间，一般制反应时间，一般5-30min。自来水冲洗中止显色。自来水冲洗中止显色。5、封片：蒸馏水洗、封片：蒸馏水洗2min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜观察结果，染成棕黄色的切片中性树胶封片。光学显微镜观察结果，染成棕黄色的切片为为c-fos表达阳性。表达阳性。选取完好切片选取完好切片4张，分别对每张切片的张，分别对每张切片的海马海马CA1区区、CA3区区、齿状回齿状回、前脑皮层前脑皮层进行显微拍照进行显微拍照（400）；）；利用利用Motic Images Advanced 3.2图像处理系统图像处理系统测

11、量测量c-fos阳性细胞阳性细胞的平均目标灰度值和阳性细胞的平均目标灰度值和阳性细胞数。灰度值代表所测阳性细胞的平均灰度，与免数。灰度值代表所测阳性细胞的平均灰度，与免疫反应的强弱呈反比关系。取疫反应的强弱呈反比关系。取4张切片，计算各张切片，计算各区平均目标灰度值与阳性细胞数的平均值，作为区平均目标灰度值与阳性细胞数的平均值，作为每个个体各区最终的灰度值和阳性细胞数。每个个体各区最终的灰度值和阳性细胞数。强弱 1、内源性生物活性及其消除内源性生物活性及其消除 生物素是生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节中所产生的羧基中间载体，催化的代

12、谢环节中所产生的羧基中间载体，在应用在应用ABC法染色时会与抗生物素蛋白结法染色时会与抗生物素蛋白结合而产生非特异性染色。对含内源性生物合而产生非特异性染色。对含内源性生物素或生物素样物质较丰富的组织，在应用素或生物素样物质较丰富的组织，在应用ABC法前，应预先以法前，应预先以0.01的抗生素蛋白的抗生素蛋白和和0.01生物素溶液分别作用生物素溶液分别作用20分钟左右，分钟左右，以消除内源性生物素活性。每次作用后应以消除内源性生物素活性。每次作用后应用用PBS洗洗5分钟，更换分钟，更换3次。次。2、生物素制剂间相互亲和性差异很大，因此、生物素制剂间相互亲和性差异很大，因此在应用在应用ABC试剂

13、时，应注意厂家和批号，试剂时，应注意厂家和批号，对购进试剂应进行事先预测，以保证实验对购进试剂应进行事先预测，以保证实验结果的稳定性。结果的稳定性。3、标记过程中应始终保持组织切片的湿润。、标记过程中应始终保持组织切片的湿润。4、在用、在用PBS缓冲液冲洗的过程应尽量冲洗完缓冲液冲洗的过程应尽量冲洗完全，片子表面不留杂质。全，片子表面不留杂质。5、准确配比抗体的浓度，因为浓度过高和过、准确配比抗体的浓度，因为浓度过高和过低都不利反应地进行，在滴加抗体的时候，低都不利反应地进行，在滴加抗体的时候，做到用量少而均匀。做到用量少而均匀。6、DAB是有毒试剂是有毒试剂，使用过程中尽量不污，使用过程中尽

14、量不污染周围环境，并且显色过程中尽量避免染周围环境，并且显色过程中尽量避免DAB见光分解。见光分解。7、滴加每种试剂做到迅速准确，以免片子在、滴加每种试剂做到迅速准确，以免片子在反应中干燥。反应中干燥。8、ABC试剂保存温度以试剂保存温度以4度为佳，据报告保度为佳，据报告保存达两年之久，仍能获得满意效果，而在存达两年之久，仍能获得满意效果，而在-20度，生物活性在短期内即被破坏。度，生物活性在短期内即被破坏。1、实验脑片中存在的是什么，是抗体，还、实验脑片中存在的是什么，是抗体，还是抗原？是抗原？2、如果所检测的物质不是、如果所检测的物质不是c-Fos，而是其，而是其他物质，那改变的是什么，一抗，二抗，他物质，那改变的是什么，一抗，二抗，还是三抗？还是三抗？