大肠菌群的测定DC法课件.ppt

1、 大肠菌群的测定 DC半固体试管快速法 一、实验目的v 熟练的掌握大肠杆菌的测定方法v 通过大肠杆菌的测定了解大肠杆菌的特性 v 熟练掌握MPN检索表的使用方法。v 熟悉DC半固体试管快速法的操作过程v 熟练掌握操作技术 二、实验原理 大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸、产气（故能使培养基变色、有气泡产生或琼脂崩裂）、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。三、实验器材v小试管（7支）大试管（3支）v量筒（100毫升的1支）v移液管1ml（3支）5ml（1支）10ml(1支）v锥形瓶250ml（1个）烧

2、杯250ml(1个）v玻璃棒 均质袋 纱布 线 剪刀 报纸 油皮纸 棉塞 洗耳球 接种针v恒温灭菌箱 恒温水浴锅 培养箱v天平 酒精灯 火柴v精密PH试纸 标签纸 v样品：面包四、药品配置v安氏指示剂的配制：酸性复红0.5g、蒸馏水100ML、氢氧化钠（IN）16ML 制法：将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液数小时后如复红退色不够。可再加12毫升氢氧化钠液。BTB指示剂的配制：溴化麝香草酚蓝指示剂、溴化麝香草酚蓝 0.1g、氢氧化钠 16g 制法：将两者在研钵研磨混合，加水稀释至250ml，制成0.04%BTB溶液。五、实验步骤（一）清洗包扎v吸管 洗净烘干后的吸管，在口吸的一端用尖头

3、摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防止菌体误吸口中，每支吸管用一条宽约45厘米，以45左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管v试管和三角瓶 试管和三角瓶都要作合适的棉花塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉花塞的制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，棉花塞的长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口 若干支管用绳子扎在一起，在棉花塞部分外包，油纸或牛皮纸再在纸外用绳扎紧。三角瓶每个单独用油纸包扎棉花塞。（二）灭菌1、干热灭菌 培养皿、移液管及

4、其他玻璃器皿可用干热灭菌。先将已包装好的上述物品放入电热干燥箱中，将温度调至160后维持2h,结束时把干燥箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50左右，将物品取出。注意事项 此过程中应注意温度的变化、不得超出170度，避免包装纸烧焦和其他不安全情况。灭菌好的器皿应保持完整的，否则易染菌。生理盐水1.成分 Nacl0.9g,蒸馏水100ml2.制法 一般每种检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包扎后于121度高压灭菌15min。2、湿热灭菌 将培

5、养基、均质袋及各种耐高温湿物品放入高压蒸汽灭菌器内，加压至1.05kg/cm2即温度达121.3，1520分钟，可杀灭细菌芽胞和各类微生物。注意事项 无菌包不宜过大（小于50cm30cm30cm），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。消毒前，打开贮槽或盒的通气孔，有利于蒸汽流通。而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒灭菌完毕，关闭贮槽或盒的通气孔，以保持物品的无菌状态。（三）培养基的制备1.成分 蛋白胨1.5g 氯化钠0.5g 乳糖1g K2HPO4.3H2O 0.3g 柠檬酸铁铵0.2g 琼脂粉（或琼脂条0.8g）0.7g 安氏指示剂2ml 蒸馏水100ml2

6、.制法 将以上固体成分加热溶解于水，调整PH7.2，随即加入两组指示剂与10%去氧胆酸钠水溶液，最后煮沸3分钟备用。3.注意事项制备DC培养基不需高压灭菌，做好后培养基为绿色，未用完DC琼脂可加热煮沸，待冷后保存于冰箱中继续使用，有效期为一年3倍DC半固体培养基，其中除蒸馏水用量不变外，其他成分按3倍量加入，制法同上制备DC培养基，其中10%去氧胆酸钠水溶液要求在校正PH后加入，以免发生胆酸沉淀（四）检验方法1.样品处理 取面包25g，用剪刀剪碎，用100ml水溶解，用均质器打成浆，再用纱布过滤。2.接种 吸取原液3个1ml，分别注入3个灭菌的试管内：再吸取1：10、1：100稀释液各3个1m

7、l分别加入灭菌的试管内，每管1ml。3.加入培养基与培养 接种1ml样品的试管，注入已溶化并冷至50c左右DC半固体培养基3ml。立即将样品与培养充分混合，待凝固后，36l温箱内，培养242小时，取出观察结果。六、结果判定1.培养基变橘红色，有气泡产生或琼脂崩裂，记录为“”2.培养基为橘红色，或有橘红色菌落无气泡和琼脂崩裂现象，记录为“+”3.培养基为绿色，有黄色菌落无气泡和琼脂崩裂现象，记录为“”4.培养基为绿色，记录为“”七、报告结果1.根据判定结果，记录阳性管数，直接查对MPN检索表，做报告。2.如遇“结果判定”中“2”、“3”反应结果，可挑23个可疑大肠菌落接种乳糖复发酵管，置37温箱

8、1824h，根据产酸产气管数查对MPN表，做报告。乳糖发酵管 成分蛋白胨20g乳糖10g0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL蒸馏水1000mLpH7.4 制法将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装3mL，并放入一个小倒管，115高压灭菌15min。检验方法1.样品处理 取可疑大肠菌群菌落，用盐水溶解。2.接种 吸取原液3个1ml，分别注入3个灭菌的试管内：再吸取1：10、1：100稀释液各3个1ml分别加入灭菌的试管内，每管1ml。3.加入培养基与培养 接种1ml样品的试管，注入已溶化并冷至50左右DC半固体培养基3ml。立即将样品与培养充分混合，待凝固后，36l温箱内，培养242小时，取出观察结果。观察结果产气大肠菌群阳性报告不产气大肠菌群阴性报告