多聚酶链式反应扩增DNA片段-总结课件.ppt

1、多聚酶链式反应多聚酶链式反应(polymerase chain(polymerase chain reaction,reaction,PCRPCR技术技术)，是一种在体外快速扩，是一种在体外快速扩增特定基因或增特定基因或DNADNA序列的方法，故又称为序列的方法，故又称为DNADNA体外扩增技术体外扩增技术。温故知新温故知新1:1:组成组成DNADNA分子的分子的基本单位基本单位是什么是什么?这些基本单位是如何连接成这些基本单位是如何连接成DNADNA分子的分子的?DNADNA分子结构有什么特点？分子结构有什么特点？12345DNADNA的基本单位的基本单位脱氧核苷酸脱氧核苷酸O OO OP

2、PO OHOHO碱基碱基O OOHOHO OO OP PO OHOHOOHOH碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖5533脱氧核苷酸链结构简图脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键磷酸二酯键A AT TG GC CA AG GC CT TDNADNA分子的平面结构分子的平面结构氢键氢键55端端33端端55端端33端端DNADNA分子的复制过程是怎样的？分子的复制过程是怎样的？DNADNA分子的复制需要哪些条件？分子的复制需要哪些条件？温故知新温故知新2 2DNADNA母链：母链：提供复制的模板提供复制的模板解旋酶：解旋酶：打开打开DNADNA

3、双链双链4 4种脱氧核苷酸：种脱氧核苷酸：合成子链的原料合成子链的原料DNADNA聚合酶：聚合酶：催化合成催化合成DNADNA子链子链ATPATP：为复制过程提供能量为复制过程提供能量引物：引物：使使DNADNA聚合酶从引物的聚合酶从引物的3 3端开始端开始连接脱氧核苷酸连接脱氧核苷酸DNADNA复制的条件复制的条件复制特点复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。DNADNA复制的方向复制的方向DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的55端向端向33端延伸端延伸1 1、DNADNA聚合酶特性聚合酶特性不能从头合成不能从头合成DNADN

4、A，只能从，只能从DNADNA的的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链，因此，因此，DNADNA复制需要引物复制需要引物2 2、DNADNA聚合酶作用过程聚合酶作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后，DNADNA聚聚合酶就能从引物的合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链，DNADNA的合成的合成方向总是从子链的方向总是从子链的55端向端向33端延伸端延伸一、基础知识一、基础知识（一）（一）PCRPCR原理：原理：在在8080100100的温度范围内，的温度范围内，DNA DNA的双螺旋结构将解体，的双螺旋结构将解体，

5、双链分开，这个过程称为变性双链分开，这个过程称为变性3 3、PCR PCR原理原理当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链又会重新链又会重新结合成双链结合成双链 PCRPCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温度来控制双的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪实质上也是一台能够仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器自动调控温度的仪器高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNADNA聚合酶聚合酶失活的问题，耐高温的失活的问题，耐高温的Taq DNAT

6、aq DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCRPCR技术的自动化技术的自动化4 4、Taq DNA Taq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用5 5、缓冲液需要为缓冲液需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质DNADNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的脱氧核苷酸，耐热的DNADNA聚合酶，同时通过控制温度使聚合酶，同时通过控制温度使DNADNA复制在体外反复进行复制在体外反复进行PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。年

7、代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、快速、快速、简便、重复性简便、重复性好、易自动化等突出好、易自动化等突出 6 6、PCR PCR技术的特点技术的特点 PCRPCR过程需要的引物是过程需要的引物是RNARNA或或DNADNA，而是人工合成的，而是人工合成的DNADNA单链，其长度通常为单链，其长度通常为20203030个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸7 7、细胞内复制和、细胞内复制和PCRPCR不同点不同点 PCRPCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的应温度的控制来实现的细胞

8、内细胞内DNADNA的复制的复制PCRPCR不不同同点点解旋解旋解旋酶，边解旋边复制解旋酶，边解旋边复制8080100100高温解旋，双链完全分高温解旋，双链完全分开开酶酶DNADNA解旋酶，解旋酶，DNADNA聚合酶，聚合酶，DNADNA连连接酶接酶TaqTaqDNADNA聚合酶聚合酶引物引物RNARNADNADNA或或RNARNA能量能量ATPATP不加不加温度温度体内温和条件体内温和条件高温高温子链子链合成合成一条链连续（先导链），另一条一条链连续（先导链），另一条链不连续，先合成片段，再由链不连续，先合成片段，再由DNADNA连接酶连接（滞后链）连接酶连接（滞后链）两条子链均连续合成两

9、条子链均连续合成相相同同点点需要提供需要提供DNADNA复制模板复制模板四种脱氧核苷酸作为原料四种脱氧核苷酸作为原料子链延伸的方向都是从子链延伸的方向都是从55端到端到33端端细胞内细胞内DNADNA的复制与的复制与PCRPCR的比较的比较PCRPCR技术的原理总结技术的原理总结利用利用DNADNA分子的分子的热变性热变性原理，通过控制温度来控制双原理，通过控制温度来控制双链的链的解旋解旋与结合，从而完成与结合，从而完成体外体外D DN NA A分子的扩增。分子的扩增。体外体外DNADNA复制的条件：复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的四种脱氧核苷酸、耐高温的DNADNA聚合酶、引物、聚合酶、

10、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。度的温控设备。复制的方向：复制的方向：子链的子链的55端向端向 3 3端延伸。端延伸。（二）（二）PCRPCR的反应过程的反应过程1 1、PCRPCR的反应步骤的反应步骤PCRPCR一般经历三十多次循环，一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸变性（模板变性（模板DNADNA解旋）解旋）模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。一定时间后，使模板以上。一定时间后，使模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双

11、链DNADNA解离，解离，使成为单链，以便于它与引物结合，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备为下轮反应作准备2 2、循环过程、循环过程靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性：加热变性复性（退火）复性（退火）模板模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到50500 0C C左右，左右，引物与模板引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合单链的互补序列配对结合靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 5533555533553333PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火延伸延伸DN

12、ADNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的的原理，合成一条新的DNADNA链链靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物553 3555533553333Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列 靶序列靶序列第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列：得到两个拷贝的靶序列3 3、3030次循环后

13、靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量循环循环次数次数DNADNA数量数量1 1 2 22 2 4 43 3 8 82020 1,048,5761,048,5763030 1,073,741,8241,073,741,824二、二、PCRPCR的反应的反应过程小结过程小结5/3 3/3/5/5/3 3/引物引物5/3/引物引物变性变性9595o oC C复性复性5555o oC C延伸延伸7272o oC C5/3 3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 252530 30 次循环（

14、复制）后，模板次循环（复制）后，模板DNADNA的含量可以扩的含量可以扩大大100100万（万（2 22020）倍以上。）倍以上。每个循环包括：每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且板参与反应，并且由引物由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与单链会与引物引物结合，进行结合，进行DNADNA的延伸，的延伸，这样，这样，DNADNA聚合酶只能聚合酶只能特异性地复制特异性地复制处于两个引物之间的处于两个引物之间的DNADNA序列，序列，使这段使这段固定长度的序列固定长度的序列呈指数扩

15、增。呈指数扩增。PCRPCR的反应的反应过程：过程：PCRPCR反应条件：反应条件：稳定的缓冲液环境稳定的缓冲液环境 DNADNA模板模板 分别与两条模板链相结合的两种引物分别与两条模板链相结合的两种引物 A A、T T、G G、C C四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 耐热的耐热的DNADNA聚合酶，一般用聚合酶，一般用TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 能严格控制温度变化的温控设备能严格控制温度变化的温控设备三、三、PCR PCR 的实验操作的实验操作1 1、PCRPCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器2 2、微量离心管、微量

16、离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体，液体，其上其上的一次性吸液枪头用一次更换一次的一次性吸液枪头用一次更换一次1 1、准备、准备2 2、移液、移液（二）实验操作步骤（二）实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的试剂摆反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上放在实验桌上用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方往微量离反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂心管里面加入各种试剂过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻过程：盖严微量离心管口的盖

17、子，用手指轻轻弹击管壁。轻弹击管壁。注意：注意：3 3、混合、混合B B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使目的是使反应液混合均匀。反应液混合均匀。A A、离心管口的盖子一定盖严，离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱防止实验中脱落或液体外溢。落或液体外溢。将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循环仪的循环程序。程序。过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上,离心约离心约10s10s。4 4、离心、离心5 5、反应、反应离心目的：使反应液体集中在离心管底部，离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效

18、果。提高反应效果。PCR三步曲三步曲 预变性预变性保温保温 变变 性性延伸延伸 72721min1min复性复性 555530s30s循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性9494，5min5min3030次次9494，30s30s5555，30s30s7272，1min1min最后一次最后一次 9494，1min1min5555，30s30s7272，1min1minPCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的污染而造成干等因素的污染而造成干扰实验，扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：6 6、注意事项、注意事项隔离操作区，

19、所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行在使用必须进行高压灭菌高压灭菌；PCRPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20-20储存。使用储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。分装试剂，简化操作程序，使用分装试剂，简化操作程序，使用一次性一次性枪头枪头（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算四、四、课题成果评价课题成果评价1 1、一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2 n n2

20、 2、a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a x2 a x2 n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定1 1、原理原理可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外的紫外线波段有一强烈的吸收峰，线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与峰值的大小与DNADNA的含量有关的含量有关稀释稀释2LPCR2LPCR反应液，加入反应液，加入98L98L蒸馏水，即将蒸馏水，即将样品进行样品进行5050倍稀释倍稀释对照调对照调零零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长26

21、0nm260nm处处，将紫外分光光度计的读数调节至零，将紫外分光光度计的读数调节至零测定测定取取DNADNA稀释液稀释液100100L L至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处的光吸收值处的光吸收值计算计算DNADNA含量（含量（g g/ml /ml）50 50(260nm(260nm的的读数）读数）稀释倍数稀释倍数2.2.过程过程比色杯比色杯五、实验小结五、实验小结 PCRPCR仪加热使（仪加热使（）变性）变性,复性使引物与模板复性使引物与模板DNADNA（）,延伸需将反应延伸需将反应温度升至中温温度升至中温(),(),在（在（）的作用下）的作用下,以以 （）为原料为原料,以

22、（以（）为复制的起点）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度合成新链。如此重复改变反应温度,经经（）三个阶段为一个循环）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍拷贝数放大一倍,一般样品是经过一般样品是经过3030次循环次循环,最终使基因放大了数百万倍最终使基因放大了数百万倍;将将扩增产物进行电泳扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的段的DNADNA带。带。模板模板互补互补TaqTaq聚合酶聚合酶四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物变性、复性和延伸变性、复性和延伸

23、72721.1.提示：绘图可参考教科书中图提示：绘图可参考教科书中图5-95-9。PCRPCR反应中的目的片段一般以反应中的目的片段一般以2n2n的方式积累，其中的方式积累，其中n n为反应循环次数。一个为反应循环次数。一个DNADNA片段在片段在3030次循环后反应物次循环后反应物中大约有中大约有1010亿个这样的片段亿个这样的片段（2 2n n=2=23030=1 073 741 824)=1 073 741 824)。2.2.提示：提示：PCRPCR引物是根据需要扩增的目标引物是根据需要扩增的目标DNADNA的碱基序列来设计的。引的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考分分子克隆实验指南子克隆实验指南（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。课后题课后题: