第四章核酸化学课件.ppt

1、第四章第四章 核酸化学核酸化学学习要求学习要求1868年，一、核酸概述一、核酸概述从外科绷带上脓细胞的从外科绷带上脓细胞的细胞核中分离得到一种细胞核中分离得到一种含含磷磷较高的较高的酸酸性物质，性物质，称之为核素（称之为核素（nucleinnuclein）核素实质是一种核糖核蛋白核素实质是一种核糖核蛋白核酸的研究历史：核酸的研究历史：18891889年，年，AltmannAltmann首先制备了不含蛋白的核酸制首先制备了不含蛋白的核酸制品，并引入品，并引入“核酸核酸”这一名词。这一名词。2020世纪世纪2020年代年代 测定了核酸的化学组成，并将核测定了核酸的化学组成，并将核酸分为酸分为DNA

2、DNA和和RNARNA。19431943年，年，E.ChargaffE.Chargaff的工作：嘌呤的工作：嘌呤:嘧啶嘧啶=1:1=1:1由由此推理出碱基配对的理论。此推理出碱基配对的理论。19441944年，年，AveryAvery的肺炎双球菌转化实验，证明遗的肺炎双球菌转化实验，证明遗传物质即为传物质即为DNADNA。19531953年，年，Watson-CrickWatson-Crick建立了建立了DNADNA的双螺旋结构的双螺旋结构模型。模型。1953 Watson1953 Watson和和CrickCrick提出提出DNADNA结构的双螺旋模型结构的双螺旋模型19196262年年获获

3、得得诺诺贝贝尔尔生生理理学学或或医医学学奖奖(25y)(35y)(35y)19611961年，年，JacobJacob和和MonodMonod提出提出操纵子学说操纵子学说 19661966年，年，NirenbergNirenberg等破译出等破译出遗传密码遗传密码19811981年，年，CechCech发现发现核酶核酶（RibozimeRibozime）19831983年，年，SimonsSimons等发现等发现反义反义RNARNA2020世纪世纪7070年代，诞生年代，诞生DNADNA重组技术重组技术。并诞生基。并诞生基因工程。因工程。2020世纪世纪9090年代开始实施年代开始实施人类基因

4、组计划人类基因组计划，开始，开始进行基因组学研究。生物技术产业空前发展。进行基因组学研究。生物技术产业空前发展。二、核酸的概念、种类、分布与功能二、核酸的概念、种类、分布与功能1.1.概概 念念细胞质细胞质细胞质细胞质（75%75%）线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体（15%15%）细胞核（细胞核（10%10%）RNA核质区（拟核）核质区（拟核）质粒质粒DNA(染色体以染色体以外的外的DNA)DNA)细胞核细胞核（95%95%）线粒体、叶绿线粒体、叶绿体（体（5%5%）DNA原核生物原核生物真核生物真核生物3.3.核酸的分布核酸的分布经典实验：经典实验：细菌转化实验：细菌转化实验：19441944，

5、AveryAvery等。等。噬菌体感染实验：噬菌体感染实验：19521952，Hershey&ChaseHershey&Chase (二二)RNA)RNA的功能：的功能：1.1.参与参与(控制控制)蛋白质的合成蛋白质的合成:rRNA(75-80%)tRNA(10-15%)mRNA(2-5%)snRNA rRNA(75-80%)tRNA(10-15%)mRNA(2-5%)snRNA 参与参与mRNAmRNA转转 录后加工录后加工 2.2.遗传物质遗传物质 3.3.具有生物催化剂功能具有生物催化剂功能 4.4.调节功能调节功能:如如 miRNA,siRNAmiRNA,siRNA等等 1928 19

6、28年，英国科学家年，英国科学家GriffithGriffith发现肺炎链球菌使小鼠死亡的原因是引发现肺炎链球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。细菌的毒性是由细胞表面中的起肺炎。细菌的毒性是由细胞表面中的多糖所决定的。多糖所决定的。肺炎球菌有两种不同的品系：肺炎球菌有两种不同的品系：*光滑型（光滑型（S S型型）：有荚膜（多糖类）、致病）：有荚膜（多糖类）、致病 *粗糙型（粗糙型（R R型型）：无荚膜、不致病）：无荚膜、不致病DNADNA是主要的遗传物质是主要的遗传物质19441944年，年，O.T.AveryO.T.Avery（美）（美）肺炎链球菌的肺炎链球菌的转化转化实验实验,首次首次证明证明

7、DNADNA是细菌遗传性状的转化是细菌遗传性状的转化因子。因子。十年后十年后证明证明DNADNA是是遗传物遗传物质质AveryAvery在在GriffithGriffith实验的基础上，实验的基础上，将从将从S S型球菌中提取的核酸、蛋白质型球菌中提取的核酸、蛋白质及多糖分别注射及多糖分别注射R R型小鼠，证明了核型小鼠，证明了核酸的遗传转化功能。酸的遗传转化功能。l1944 Avery 等成功进行肺炎球菌转化试验；等成功进行肺炎球菌转化试验；DNADNA是主要的遗传物质是主要的遗传物质19521952年，美国冷泉港年，美国冷泉港 Hershey-ChaseHershey-Chase噬菌体浸染

8、细菌的实验。噬菌体浸染细菌的实验。(侵染大肠杆菌的病毒侵染大肠杆菌的病毒)35S32PFig.3-2 The Hershey-Chase experiment.RNARNA生物学功能生物学功能RNARNA的功能：的功能：1.1.参与参与(控制控制)蛋白质蛋白质的合成的合成 rRNA(75-80%)rRNA(75-80%)tRNA(10-15%)tRNA(10-15%)mRNA(2-5%)mRNA(2-5%)2.2.遗传物质遗传物质3.3.具有生物催化剂功具有生物催化剂功能能4.4.调节功能调节功能:如如 miRNA,siRNAmiRNA,siRNA等等一）核酸的元素组成一）核酸的元素组成 基本

9、元素：基本元素：C H O N C H O N P P 核酸的元素组成有两个特点：核酸的元素组成有两个特点：1.1.一般不含一般不含S S。2.P2.P含量较多，并且恒定（含量较多，并且恒定（9%-10%9%-10%）。）。因此，实验室中用因此，实验室中用定磷法定磷法进行核酸的进行核酸的定量分析。（定量分析。（DNA9.9%DNA9.9%、RNA9.5%RNA9.5%）二）核酸的分子组成二）核酸的分子组成戊糖戊糖 碱基碱基磷酸磷酸 核苷核苷核苷酸核苷酸核酸核酸 嘌呤碱嘌呤碱嘧啶碱嘧啶碱核糖核糖脱氧核糖脱氧核糖核苷酸的基本结构核苷酸的基本结构）核苷酸中的戊糖）核苷酸中的戊糖OHHOHHOHOHH

10、HOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖DNADNARNARNARNARNA中修饰戊糖中修饰戊糖D-2-O-甲基核糖甲基核糖）核苷酸中的碱基）核苷酸中的碱基尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶胞嘧啶(2)(2)嘌呤碱嘌呤碱(purine)(purine)：由嘌呤衍生而来。由嘌呤衍生而来。RNA：A、G、C、U碱基碱基DNA：A、G、C、T碱基碱基 核酸中除了核酸中除了5 5类基本的碱基外，还有一些含量类基本的碱基外，还有一些含量甚少的碱基，称为甚少的碱基，称为稀有碱基，大多数为甲基稀有碱基，大多数为甲基化碱基。化碱基。7-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤 mG次黄嘌呤次黄嘌呤3 3）

11、核苷）核苷 修饰核苷修饰核苷5-5-甲基脱氧胞苷甲基脱氧胞苷2-O-2-O-甲基胞苷甲基胞苷次黄嘌呤核苷次黄嘌呤核苷假尿苷（假尿苷（）DNADNA的甲基化导致基因沉默的甲基化导致基因沉默核苷的表示核苷的表示：DNA,RNADNA,RNA中主要的碱基、核苷中主要的碱基、核苷 核糖核糖核苷核苷脱氧核脱氧核糖核苷糖核苷4 4）核苷酸）核苷酸n(1)(1)分类分类(2)(2)结构结构n作为作为DNADNA或或RNARNA结构单元的核苷酸分别是结构单元的核苷酸分别是5-脱脱氧核糖核苷酸和氧核糖核苷酸和5-核糖核苷酸核糖核苷酸。OBOH OHOH2CPOHHOOB=腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶

12、核糖核苷酸 OH2CPOHHOOOBOH脱氧核糖核苷酸DNA,RNADNA,RNA中主要的碱基、核苷和核苷酸中主要的碱基、核苷和核苷酸 (3)(3)表示：表示：NOCH2OOHOHNNNNH2POOHOP OOHOP OOHOHNOCH2OOHOHNNNNH2POOHOP OOHOH(4)(4)特殊核苷酸：特殊核苷酸：b.b.多磷酸核苷酸：多磷酸核苷酸：指含两个以上磷酸基的核苷酸指含两个以上磷酸基的核苷酸,如如ADP ADP、ATP ATP、GDPGDP、GTP GTP、UDPUDP和和UTPUTP等等.ATP ATP在细胞能量代谢上起着极其重要的作用。在细胞能量代谢上起着极其重要的作用。UT

13、PUTP参与糖原合成作用以供给能量参与糖原合成作用以供给能量,UDPUDP有携带有携带转运葡萄糖的作用。转运葡萄糖的作用。GDPGDP和和GTPGTP为蛋白质生物合成的起始和延伸提供为蛋白质生物合成的起始和延伸提供能量。能量。NADNAD+、NADPNADP+、CoA-SHCoA-SH、FAD FAD 等都含有等都含有 AMP;AMP;NADNAD+及及FADFAD是生物氧化体系的重要组成成分，是生物氧化体系的重要组成成分，在传递氢原子或电子中有着重要作用。在传递氢原子或电子中有着重要作用。CoACoA作作为有些酶的辅酶成分为有些酶的辅酶成分,参与糖有氧氧化及脂肪参与糖有氧氧化及脂肪酸氧化过程

14、。酸氧化过程。2.2.核苷酸的连接方式核苷酸的连接方式2)2)核酸的一级结构核酸的一级结构5 3 结构式结构式5 3 p p p pOH3 ACTG1 线条式线条式5 ACTGCATAGCTCGA 3 字母式字母式(1)(1)一级结构表示方法如下一级结构表示方法如下(2)(2)读向：读向：1 1、核酸是生物体遗传变异的物质基础，、核酸是生物体遗传变异的物质基础，DNADNA是大多数生物体的遗传物质。是大多数生物体的遗传物质。2 2、RNARNA主要参与蛋白质的生物合成。主要参与蛋白质的生物合成。3 3、RNARNA的功能多样性。主要有：参与基因的功能多样性。主要有：参与基因表达的调控、催化作用

15、、遗传信息的加工、表达的调控、催化作用、遗传信息的加工、病毒病毒RNARNA是遗传信息的载体。是遗传信息的载体。4 4、核酸与分子病。、核酸与分子病。四、四、DNA（二）（二）DNA的双螺旋二级结构的双螺旋二级结构chargaffchargaff碱基配对碱基配对原则原则2 2DNADNA双螺旋结构的特点双螺旋结构的特点嘌呤碱和嘧啶嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的碱基位于螺旋的内侧内侧，磷酸和脱氧核糖基位磷酸和脱氧核糖基位于螺旋于螺旋外侧外侧，彼此以，彼此以3,5-3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键连接，形成连接，形成DNADNA分子分子的骨架。碱基环平面的骨架。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基与螺旋轴垂直，糖

16、基环平面与碱基环平面环平面与碱基环平面成成9090角。角。2.0 nm小小沟沟大大沟沟这种配对排列源于糖这种配对排列源于糖-磷酸根磷酸根骨架的空间限制因素骨架的空间限制因素3.DNA3.DNA双螺旋结构提出的生物学意义双螺旋结构提出的生物学意义 该模型揭示了该模型揭示了DNADNA作为遗传物质的稳定性特征，作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了最有价值的是确认了碱基配对原则碱基配对原则，这是，这是DNADNA复制、复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础的分子基础,它奠定了生物化学和分子生物学乃至整它奠定了生物化学和分子

17、生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。推动了分子生物学和分个生命科学飞速发展的基石。推动了分子生物学和分子遗传学的发展，被誉为子遗传学的发展，被誉为2020世纪最伟大的发现之一。世纪最伟大的发现之一。n19621962年，沃森和克里克与莫里斯年，沃森和克里克与莫里斯威尔金斯一起因发现威尔金斯一起因发现DNADNA双螺双螺旋结构赢得了诺贝尔奖。旋结构赢得了诺贝尔奖。4 4、双螺旋结构的稳定因素、双螺旋结构的稳定因素nDNADNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的，双螺旋结构在生理条件下是很稳定的，维持这种稳定性的因素包括：维持这种稳定性的因素包括：氢键氢键A=TA=T，GCGC。氢键虽然是弱键，但

18、大氢键虽然是弱键，但大量氢键的总作用力是很大量氢键的总作用力是很大的的。碱基形状扁平，分布于双螺旋内侧。碱基形状扁平，分布于双螺旋内侧。大量的碱基层层堆积，相邻碱基的平大量的碱基层层堆积，相邻碱基的平面十分接近，这样，芳香环上面十分接近，这样，芳香环上N N原子原子电子云交错产生一定的吸引力，就电子云交错产生一定的吸引力，就是是碱基堆积力碱基堆积力。碱基呈疏水性，双螺旋结构内部形成碱基呈疏水性，双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，消除了介质中水一个强大的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响，利于碱分子对碱基之间氢键的影响，利于碱基之间形成氢键。基之间形成氢键。所以碱基堆积力是所以碱基

19、堆积力是DNADNA双螺旋稳定的双螺旋稳定的最主要因素最主要因素。碱基堆积力碱基堆积力另外，各种阳离另外，各种阳离 子，子，如多胺，组蛋白，如多胺，组蛋白，Na+,K+,Mg 2+能与能与DNA分子中带负电荷分子中带负电荷的磷酸基团作用，降的磷酸基团作用，降低了两条低了两条DNA链之间链之间的静电排斥力，也有的静电排斥力，也有助于双螺旋的稳定助于双螺旋的稳定.改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。5 5、二级结构的其它类型、二级结构的其它类型nWatsonWatson和和CrickCrick提出的提出的DNADNA双螺旋构象现在称为双螺旋构

20、象现在称为B-B-DNA,DNA,它代表它代表DNADNA钠盐在相钠盐在相对湿度对湿度92%92%时时制得的纤维制得的纤维结构，比较接近生理条件结构，比较接近生理条件下细胞内大部分下细胞内大部分DNADNA的构的构象。象。nDNADNA还有其它双螺旋构象还有其它双螺旋构象类型类型:A,C,D,E,ZA,C,D,E,Z型。另外型。另外还有还有三股螺旋三股螺旋DNADNA。A-DNAn 当当DNADNA钠盐纤维相对湿度和盐的种类改变时，钠盐纤维相对湿度和盐的种类改变时，DNADNA的构象发生改变。的构象发生改变。Z-DNA Z-DNA A-DNAA-DNA、B-DNAB-DNA和和Z-DNAZ-D

21、NA的主要结构特点的主要结构特点结构特点结构特点 A-DNAA-DNAB-DNAB-DNAZ-DNAZ-DNA螺旋方向右手右手左手每一碱基对旋转角度 32.734.630每一转的碱基对数1110.4 12碱基对相对螺旋轴的倾斜角度 191.29每一碱基对沿螺旋轴上升的距离0.23nm 0.33nm0.38nm螺距2.46nm3.40nm4.56nm螺旋直径 2.55nm 2.37nm 1.84nm 三股螺旋三股螺旋DNA DNA（triplex)triplex)ts-DNAts-DNATATHoogsteenHoogsteen氢键氢键Ts-DNATs-DNAH-DNAH-DNACGC+三股螺旋

22、结构三股螺旋结构通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：(三）三）DNADNA的三级结构的三级结构-超螺旋超螺旋1 1、超螺旋结构、超螺旋结构使使DNADNA形成高度致密状态从而得以装入核中；形成高度致密状态从而得以装入核中；推动推动DNADNA结构的转化以满足功能上的需要。结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分 开导致局部变性，利于复制和转录。开导致局部变性，利于复制和转录。2、n 在真核细胞染色质中，DNA双螺旋分子盘绕在组蛋白上形成

23、核小体。n许多核小体由DNA连成念珠状结构，再盘绕压缩成高层次的结构染色体。Fig.3-8 Structure of DNA(146bp)wrapped around a nucleosome core.The DNA is bound in a left-handed solenoidal supercoil that circumnavigates the histone complex 1.8 times.146bpDNA以以左手螺旋左手螺旋在在组蛋白核心组蛋白核心上缠绕上缠绕1.8圈。圈。组蛋白八聚体：组蛋白八聚体：H2A H2B H3 H4H2A H2B H3 H4各各2 2个分子个

24、分子从从DNADNA到染色质丝，到染色质丝，DNADNA压缩压缩了近了近100100倍，若从倍，若从DNADNA到最后到最后凝缩成染色体，凝缩成染色体，DNADNA压缩了近压缩了近万倍。万倍。3.DNA3.DNA拓扑性质拓扑性质 连环数连环数(linking number(linking number，L L)：指一条链以右：指一条链以右手螺旋绕另一条链的次数。手螺旋绕另一条链的次数。n 扭转数扭转数（twisting number,twisting number,T T）：）：Watson-Watson-Crick Crick 螺旋数目。螺旋数目。n 超螺旋数超螺旋数（缠绕数，（缠绕数，wr

25、ithing number,writhing number,W W）nW0,即即L0,即即LT,正超螺旋（右手）正超螺旋（右手）（四）（四）DNADNA的功能的功能1、DNA一级结构的特点 基因：是含特定遗传信息的核苷酸序列（DNA或RNA）是遗传物质的最小功能单位。若干bp(一个基因)多个基因 DNA+蛋白质 染色体1 1）原核生物基因组：）原核生物基因组：n C、2 2）真核生物基因组：）真核生物基因组：内含子与外内含子与外显子显子2 2、DNADNA是遗传信息的载体是遗传信息的载体3 3、DNADNA是变异的物质基础是变异的物质基础五、五、RNA RNA与与DNA的差异的差异 DNA R

26、NA糖糖 脱氧核糖脱氧核糖 核糖核糖碱基碱基 AGCT AGCU 不含稀有碱基不含稀有碱基 含稀有碱基含稀有碱基（二）（二）RNARNA的类型的类型 此外，在真核细胞中还有少量：此外，在真核细胞中还有少量：核内小RNA（snRNA）:参与核糖体的组成。不均一RNA（hnRNA）：mRNA的前体。反义RNA（asRNA）：可与mRNA部分或全部序列互补；抑制DNA复制、转录；抑制mRNA翻译。1.tRNA1 1）tRNAtRNA结构：结构：n分子量分子量2500025000左右，大约由左右，大约由70709090个核苷酸组个核苷酸组成，沉降系数为成，沉降系数为4S4S左右。左右。n分子中含有较多

27、的修饰成分分子中含有较多的修饰成分(。n3-3-末端都具有末端都具有CpCpAOHCpCpAOH的结构。的结构。5-5-端多端多为为pG,pG,也有也有pCpC。tRNA tRNA的的二级结构二级结构 二级结构二级结构为三叶草为三叶草 有：有：氨基酸臂、氨基酸臂、二氢嘧啶环、二氢嘧啶环、反密子码环、反密子码环、可变环、可变环、T TC C 环环A、在蛋白质合成中转运氨基酸；B、在蛋白质合成的起始、DNA反转录合成及其它代谢调节中起作用。2.2.mRNA和和hnRNAnmRNAnhnRNA(为为mRNA前前体体合成合成mRNA切除内含子切除内含子2)mRNA2)mRNA结构特点：结构特点：33末

28、端有末端有polyApolyA结构结构：与与mRNAmRNA从核入质有关，与从核入质有关，与mRNAmRNA半寿期有关。半寿期有关。55末端有帽子结构末端有帽子结构：G G被甲基化，抗核酸酶的水解；被甲基化，抗核酸酶的水解；与蛋白质合成起始有关；作为与蛋白质合成起始有关；作为mRNAmRNA与核糖体与核糖体40S40S亚基结亚基结合的信号。合的信号。5 5 7O-CH3331指指55端核糖端核糖甲基化的情况甲基化的情况5 5，5 5-三磷酸相连接三磷酸相连接真核细胞真核细胞mRNAmRNA的一般结构为：的一般结构为：AUG起始起始密码密码帽状帽状结构结构不翻不翻译区译区翻译区翻译区UGAUAG

29、UAA不翻不翻译区译区polyA1)5端有甲基化的帽子，端有甲基化的帽子，3端有端有polyA尾巴；尾巴；2)一般为单顺反子结构，即一条一般为单顺反子结构，即一条mRNA链中链中只含有一条多肽链信息，能指导一个蛋白只含有一条多肽链信息，能指导一个蛋白质的生物合成；质的生物合成；3）mRNA代谢很慢，代谢半衰期长。代谢很慢，代谢半衰期长。原核细胞原核细胞mRNAmRNA的结构的结构3)功能：是蛋白质合成的模板,3.rRNA 3.rRNA(核糖体核糖体RNARNA，ribosomal RNA-rRNAribosomal RNA-rRNA）核糖体的组成核糖体的组成n原核细胞：70S核糖体；n真核细胞

30、：80S核糖体；3470S50S30S5S rRNA，23S rRNA3434种蛋白质种蛋白质16S rRNA2121种蛋白质种蛋白质80S60S40S5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA4949种蛋白质种蛋白质18SrRNA3333种蛋白质种蛋白质(三三)RNA)RNA的功能的功能调节功能调节功能:如如 miRNA,siRNAmiRNA,siRNA等等六、核蛋白体六、核蛋白体头头部部颈颈圈圈尾尾部部基基板板尾尾丝丝尖尖钉钉噬菌体噬菌体T T2 2结构结构组蛋白八聚体：组蛋白八聚体：H2A H2B H3 H4H2A H2B H3 H4各各2 2个分子个分子从从DNADNA到染色质丝，

31、到染色质丝，DNADNA压缩压缩了近了近100100倍，若从倍，若从DNADNA到最后到最后凝缩成染色体，凝缩成染色体，DNADNA压缩了近压缩了近万倍。万倍。七、核酸的重要理化性质七、核酸的重要理化性质（一）一般理化性质n RNARNA的等电点比的等电点比DNADNA低的原因，是低的原因，是RNARNA分子中核分子中核糖基糖基2-OH2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNADNA没有没有这种作用。这种作用。（二）、（二）、加热条件下，D核糖浓盐酸苔黑酚 D2脱氧核糖酸二苯胺 二种反应可作定性试验，定量试验灵敏度低、准确性差，但快、简便。（三）紫外吸收

32、性质（三）紫外吸收性质 3 3、紫外线可使相邻、紫外线可使相邻TTTT间形成共价结合的间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，引起基因突变。胸腺嘧啶二聚体，引起基因突变。A=TC=GT=AT=AA=TC=GT AT A（四）核酸结构的稳定性（四）核酸结构的稳定性（五）核酸的变性（五）核酸的变性2.DNA2.DNA的热变性和解链温度（的热变性和解链温度（TmTm）3.3.影响影响TmTm的因素：的因素：（六）核酸的复性（六）核酸的复性变性的两条呈单链状态的变性的两条呈单链状态的DNADNA，经复性又重新形成双，经复性又重新形成双螺旋结构时，其溶液的螺旋结构时，其溶液的A A260260值比复性前减小，这

33、种现值比复性前减小，这种现象称为象称为减色效应。减色效应。(七七)核酸的杂交（核酸的杂交（hybridizationhybridization）DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子制备特定的探针（制备特定的探针（probeprobe）通过杂交技术可进行基因）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。的检测和定位研究。探针（探针（probe)八、八、核酸分析技术核酸分析技术 核酸的分离纯化核酸的分离纯化 序列分析（略）序列分析（略）破碎细胞（裂解）破碎细胞（裂解）去除蛋白质（去除蛋白质（SDS-SDS-苯酚抽提或用氯仿苯酚抽提或用氯仿异戊醇）

34、。异戊醇）。振荡振荡冷冻离心冷冻离心 DNA DNA 或或RNARNA溶于上层水相，变性溶于上层水相，变性蛋白在中间界面（反复多次）蛋白在中间界面（反复多次）70%70%冷乙醇沉淀冷乙醇沉淀尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌抑制核酸酶抑制核酸酶(DEPC:焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯)(一)、核酸的分离纯化超螺旋超螺旋DNADNA或或不同构象的核酸（线形、环不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），浮力密度不同，形、超螺旋），浮力密度不同，用溴化乙锭用溴化乙锭-CsCl-CsCl密度梯度离密度

35、梯度离心可以将不同构象心可以将不同构象DNADNA、RNARNA与与蛋白质区分开来蛋白质区分开来.这一方法常用于质粒这一方法常用于质粒DNADNA的的纯化纯化.溴化乙锭溴化乙锭-CsCl密度梯度离心密度梯度离心(Ethidium bromide,EB)1、Southern印迹法印迹法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上固定（固定（8080，4-6h4-6h）与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交（高盐浓度，（高盐浓度，6868，几小时），几小时）放射自显影放射自显影带有带有DNA片段的凝胶片段的凝胶变性（变性

36、（NaOH 0.5mol/LNaOH 0.5mol/L）凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern BlottingSouthern Blotting可用于可用于DNADNA之间同源之间同源性分析性分析鉴定技术鉴定技术2、Northern Blotting 研究对象是研究对象是mRNAmRNA，探针一般是，探针一般是DNADNA。总总RNARNA或或mRNAmRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）3、Western Blotting抗原与抗体的杂交抗原与抗体的杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术

37、。研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。4.4.核酸含量测定核酸含量测定（二）序列分析（二）序列分析测定测定1000bp以上的以上的DNA序列序列（三）、（三）、PCRPCR与与RT-PCRRT-PCR技术技术九、九、基因组学简介基因组学简介 相异相异：试比较核酸、蛋白质一级结构的不同，写出各自基本结构单位的通式试比较核酸、蛋白质一级结构的不同，写出各自基本结构单位的通式 比较项目比较项目蛋白质蛋白质 核酸核酸基本结构单位基本结构单位连接的键连接的键主链的组成主链的组成（不变成分）（不变成分）侧链侧链（可变成分）（可变成分）基本结构单位通式基本结构单位通式核苷酸核苷酸氨基酸氨基酸肽键肽键3，5-磷酸二酯键磷酸二酯键由由-N-C-CO-反复循环组成反复循环组成由戊糖由戊糖+磷酸磷酸反复循环组成反复循环组成R侧链侧链碱基碱基H2N-CH-COOHRH2PO3-O-H2C(O)HHON