第六章稳定性同位素示踪法课件.ppt

1、 第六章第六章 稳定性同位素示踪法稳定性同位素示踪法 概述：概述：1、1912年，年，Thomson首发现稳定性核素首发现稳定性核素20Ne和和22Ne（氖）。（氖）。2、1929年，年，Naude发现了发现了15N。3、1937年，年，Urey等首次报道人工生产等首次报道人工生产15N的的方法。方法。4、1940年，先后获得具生物意义的年，先后获得具生物意义的15N、18O和和3H大量生产。大量生产。5.1947年年9月在美国月在美国Wisconsin大学召开了大学召开了“同位素同位素在生物学和医学中应用在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开始专题讨论会，从此开始了了稳定性核素示踪技术应用

2、的新纪元。稳定性核素示踪技术应用的新纪元。6.近近20年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方法取得了较大突破，法取得了较大突破，13C、2H、18O、15N广泛应用于生物广泛应用于生物学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域。我学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域。我国先后分离了国先后分离了25种元素的种元素的100多种稳定性核素，例如：多种稳定性核素，例如：15N标记化合物就有标记化合物就有30余余 种。种。几个概念几个概念 稳定性同位素稳定性同位素（Stable isotope）丰度丰度（Abundance）A 即某核在该组同位素中

3、浓度即某核在该组同位素中浓度(通常指人工加浓通常指人工加浓了了 的的)。自然丰度自然丰度（Natural abundaa）A自自(AO)15N：0.365%、18O:0.204%原子百分超原子百分超（Atom percent excess）a a=A-A自自 又称富集度（又称富集度（Enrichment）富集富集15N（Enriched15N）贫化贫化15N（Depeled15N)一一.稳定性同位素示踪法的基本依据：稳定性同位素示踪法的基本依据：1.自然界中一种元素同位素组成是自然界中一种元素同位素组成是相对恒定相对恒定 2.同一元素的同位素具有同一元素的同位素具有相同的化学性质相同的化学性质

4、 3.同一元素的同位素之间存在同一元素的同位素之间存在质量差异质量差异 重要化学元素的稳定性同位素重要化学元素的稳定性同位素元素元素 同位素同位素 自然丰度自然丰度 样品来源样品来源H 1H 99.985 新鲜的表面淡水新鲜的表面淡水 2 H(D)0.0147 B 10B 18.46 意大利天然硼酸盐意大利天然硼酸盐 11B 81.54C 12C 98.892 捷克扑利兹石灰石捷克扑利兹石灰石 13C 1.108 N 14N 99.635 大气中的氮气大气中的氮气 15N 0.365O 16O 99.759 大气中的氧气大气中的氧气 17O 0.0374 18O 0.2039 氮的同位素表氮的

5、同位素表同位素同位素 射线种类射线种类 半衰期半衰期 自然丰度自然丰度12N +0.011S13N +9.96m14N -99.635-99.63515N -0.365-0.36516N -7.1S17N -4.15S18N -0.63S 稳定性同位素标记物的命名稳定性同位素标记物的命名 1978年国际纯化学和化学联合会年国际纯化学和化学联合会IUPAC的命名的命名法法:1.结构式结构式:15NHCl 或或15NHCl（这样純的（这样純的物质不存在物质不存在)2.单标记化合物单标记化合物:H215N-CO-NH2 15N-尿素，尿素，例如例如15N的丰度可为的丰度可为5%，10%，15%3.双

6、标记化合物双标记化合物(一个同位素一个同位素):H215N-CO-15NH2尿素尿素4.混合标记化合物混合标记化合物:(15NH2)13CO (13C15N)尿尿素素 核素核素 A（%）质量数质量数 14N 99.635 14 15N 0.365 15注意：由于同位素之间的质量差异，因此注意：由于同位素之间的质量差异，因此它们的物理、化学、生物化学等性质会有它们的物理、化学、生物化学等性质会有所不同，进行实验时，需注意所不同，进行实验时，需注意同位素效应同位素效应。二二.稳定性同位素示踪法的特点：稳定性同位素示踪法的特点：1.无放射性，无辐射效应及不良影响。无放射性，无辐射效应及不良影响。2.

7、安全、对人无伤害。安全、对人无伤害。3.无污染，不受环境条件限制。无污染，不受环境条件限制。4.无衰变，实验时间不受限制。无衰变，实验时间不受限制。5.可进行放射性示踪法难以进行的实验。可进行放射性示踪法难以进行的实验。例：例：N素中素中T最长的最长的13N：T=9.096m一一 三三.稳定性同位素分析法的基本流程稳定性同位素分析法的基本流程 同位素引入生物体同位素引入生物体 动植物原始样品动植物原始样品 仪器所需的待测样品仪器所需的待测样品 进样过程进样过程 质谱分析法质谱分析法 光谱分析法光谱分析法 记录记录 实验结果分析实验结果分析 四四 .影响影响1515N N引入丰度的因素引入丰度的

8、因素 1.1.实验材料对实验材料对1515N N的稀释程度。的稀释程度。2.N2.N素在不同部位分布的不均匀性素在不同部位分布的不均匀性 3.3.分析测定技术所能达到的精度。分析测定技术所能达到的精度。1515N N示踪法引入示踪法引入N N素肥料的丰度计算素肥料的丰度计算 参考公式参考公式 a af f=W=Wp p R Rp p a ap p/N/Nf f R RN N式中：式中：a af f：N N素肥料的原子百分超素肥料的原子百分超 W Wp p：植物总重量（待测）：植物总重量（待测）a ap p：植物样品中原子百分超：植物样品中原子百分超 R Rp p：植物样品中含：植物样品中含N

9、N百分率百分率 N Nf f：施纯：施纯N N量量 R RN N：N N肥利用率肥利用率 注意事项：注意事项：1.1.同位素交换反应：同位素交换反应：在一定条件下，标记在一定条件下，标记的铵盐可与大气发生反应：的铵盐可与大气发生反应：1515NHNH+4 4水溶液水溶液+1414NHNH3 31414NHNH+4 4水溶液水溶液+1515NHNH3 3 1515N N丰度高时应注意。丰度高时应注意。2.2.同位素效应：同位素效应：藻类对藻类对1414C C、1313C C、1212C C的吸的吸收依次递减。收依次递减。3.3.予测样品测定项目予测样品测定项目 五、质谱和光谱测定五、质谱和光谱测

10、定1515N N原理原理 1414N N和和1515质量不同质量不同质谱：把质谱：把N N2 2离子化为离子化为2828N-NN-N2 2，2929N-NN-N2 2，3030N-NN-N2 2 使其使其 在在均匀磁场均匀磁场中发生不同角度偏转中发生不同角度偏转 2 2光谱：光谱：2828N-NN-N2 2：谱线波长为谱线波长为2976.82976.8埃埃 2929N-NN-N2 2：谱线波长为谱线波长为2982.92982.9埃埃 3030N-NN-N2 2：谱线波长为谱线波长为2988.62988.6埃埃-入口入口出口出口加加速速电电压压1800的均匀磁场的均匀磁场 六六.供仪器待测样品的

11、制备、测量供仪器待测样品的制备、测量 1.1.对待测样品的要求：对待测样品的要求：(1)(1)因为测量的是不同质量离子流的相对含因为测量的是不同质量离子流的相对含量，因此，保证有一定的量，因此，保证有一定的N N量即可。一般要求量即可。一般要求含含N N量量1mg/ml1mg/ml最少不低于最少不低于0.5mg0.5mg。(2)(2)仪器的本底检查。仪器的本底检查。(3)(3)离子峰的选择（离子峰的选择（1414N N和和1515N N的峰比的峰比2828N N、2929N N小小1010倍，选倍，选2828N N、2929N N、3030N N）。）。(4)(4)仪器精确度检查（检查去仪器精

12、确度检查（检查去O O2 2后的空气或后的空气或纯纯N N气）。气）。2.2.分析样品的制备：分析样品的制备：(1)K(1)K氏法（氏法（KjeidaliKjeidali）质谱分析常用法。质谱分析常用法。A.A.样品的消化：样品的消化：（例：（例：0.05g0.05g植样植样+10ml+10ml浓浓H H2 2S0S04 4+3.3gSe:CuSO+3.3gSe:CuSO4 4:K:K2 2SOSO4 4为为1:10:1001:10:100混合催化剂混合催化剂样液清亮再消煮样液清亮再消煮5h5h（土土）或）或2h(2h(植植)，温度，温度120-140120-140。样品予处理：水杨酸样品予处

13、理：水杨酸硫酸法：硫酸法：5g5g干土干土或或0.5g0.5g植样植样+12ml+12ml水杨酸：硫酸为水杨酸：硫酸为50g50g：1000ml1000ml溶液中放置溶液中放置30min30min，再加，再加2.5g2.5g硫硫代硫酸钠和代硫酸钠和15ml15ml水，缓缓加热至停出起水，缓缓加热至停出起泡泡冷却冷却常规消化）。常规消化）。B.B.蒸馏：蒸馏：用蒸汽蒸馏将消化液中用蒸汽蒸馏将消化液中NHNH3 3分离出来，分离出来，并测定总并测定总N N。方法：方法：消化液中加过量消化液中加过量40%NaOH,40%NaOH,释放的释放的NHNH3 3被蒸汽逐出，经冷凝后被被蒸汽逐出，经冷凝后被

14、2%2%硼酸吸收，加硼酸吸收，加入混合指示剂用标准硫酸滴定（设置一个入混合指示剂用标准硫酸滴定（设置一个标准液）。标准液）。此步骤将此步骤将NHNH3 3-N-N转变成了转变成了NHNH4 4+-N-N（铵态（铵态N N），），仪器分析适宜量仪器分析适宜量1mgN/1mgN/样品样品2-3ml(2-3ml(浓缩或浓缩或稀释稀释)。(制备好的样品送交仪器分析制备好的样品送交仪器分析)以下在质谱仪上进行以下在质谱仪上进行C.C.将将NHNH4 4+-N-N转化为转化为N N2 2气气 :在真空条件下，将上述样品与次溴酸在真空条件下，将上述样品与次溴酸钠反应，放出钠反应，放出N N气（在质谱仪内进行

15、）气（在质谱仪内进行）详见书详见书1515N N章节。章节。制样时注意：制样时注意：1.1.所有试剂纯度要高。所有试剂纯度要高。2.2.消化要完全。消化要完全。3.3.防止样品间交叉污染（每个样品防止样品间交叉污染（每个样品蒸馏前用蒸馏蒸馏前用蒸馏15ml15ml乙醇洗器皿）。乙醇洗器皿）。4.“Y”4.“Y”型管及内部反应抽气须彻底，型管及内部反应抽气须彻底，防其它气体干扰。防其它气体干扰。以下在光谱仪上进行以下在光谱仪上进行,可用液体样可用液体样品也可用干样品品也可用干样品(2).(2).杜马法（杜马法（DumasDumas）光谱分析中常用法光谱分析中常用法适用于含适用于含N N量低（少于

16、量低（少于100 100 g g）的样品，光谱测量。的样品，光谱测量。方法：方法：A A在放电管中装入在放电管中装入样品样品，氧化剂氧化剂（CuOCuO）及及吸收剂吸收剂（CaOCaO）抽真空，抽完后熔封放）抽真空，抽完后熔封放电管。电管。在马福炉中燃烧在马福炉中燃烧0.5-3h0.5-3h（560560）样品，）样品，（CaOCaO吸收吸收COCO2 2和和H H2 2O)O)以产生以产生N N2 2气气。B B冷却至室温后在光谱仪上测定冷却至室温后在光谱仪上测定 纯样品火焰为纯样品火焰为粉红色粉红色或或淡黄色淡黄色 有有COCO2 2呈呈白色白色，有水呈，有水呈黄色黄色）注意：注意：如果是

17、如果是液体样品液体样品。需用。需用PyrexPyrex玻玻璃管（璃管（1cm 2mm1cm 2mm）吸满样液，烘）吸满样液，烘干后再放入放电管。干后再放入放电管。CuOCuO、CaOCaO使用前用使用前用700700高温高温烘干除去烘干除去COCO2 2，H H2 2O O，并在，并在12-12-18Kg/cm18Kg/cm2 2压力下制成棒状压力下制成棒状,备光谱备光谱分析分析 仪器分析方法步骤：仪器分析方法步骤：1 1、通电予热仪器、通电予热仪器1010分钟，分钟，打开打开光电倍增管高压。光电倍增管高压。2 2、放电管、放电管装入装入燃烧室固定架上。燃烧室固定架上。3 3、开开高频发生器电

18、源，使放电管中样品放电发光。高频发生器电源，使放电管中样品放电发光。4 4、选择选择适宜放大倍数对适宜放大倍数对2828N N、2929N N、3030N N峰分别进行峰分别进行放大，在放大，在2970A2970A0 0-2990A-2990A0 0之间扫描。之间扫描。5 5、放下放下记录笔，记录笔，接通接通扫描开关，划出扫描开关，划出2828N N、2929N N、3030N N峰高。峰高。6 6、求得求得平均峰高，平均峰高，计算计算1515N N丰度。丰度。七七1515N N实验结果计算实验结果计算 1414、1515的质量比的质量比2828、2929、3030的小的小1010倍，倍，不参

19、加运算不参加运算 当当1515N N丰度小于丰度小于5%:5%:R R=质量为质量为2828离子流强度离子流强度/质量为质量为2929离离子流强度子流强度 此时此时3030N N的流子离强度很小，的流子离强度很小，1.1.丰度丰度：A A=1/2R+1=1/2R+1100%100%(1)(1)当当1515N N丰度大于丰度大于5%5%R R=质量为质量为2929离子流强度离子流强度/质量为质量为3030离子流强度离子流强度 A A=2/R=2/R+2+2 100%100%或者由质量为或者由质量为2828、2929、3030的峰值直接算出：的峰值直接算出：A A=29+230/2 29+230/

20、2（28+29+30)28+29+30)100%100%以下以植物材料实验为例进行计算，以下以植物材料实验为例进行计算，其计算原理也适用于动物等，共同的条件其计算原理也适用于动物等，共同的条件是在一个相对封闭系统内开展实验。（若是在一个相对封闭系统内开展实验。（若是用是用3232P P等实验，计算时把原子百分超换成等实验，计算时把原子百分超换成比强度即可）比强度即可）2.2.植样的原子百分超植样的原子百分超:a ap p a ap p =A-A=A-A自自 （2 2）（A A自自=0.365%=0.365%或空白实验值）或空白实验值）3.3.植物从肥料中摄取植物从肥料中摄取N N的的%:%:N

21、 Ndffdff 植 物 中植 物 中 N N 有 多 少有 多 少%是 来 自 于 肥 料是 来 自 于 肥 料（Percentage of in the plant derived Percentage of in the plant derived from the fertilizerfrom the fertilizer），可以是根、茎、叶、），可以是根、茎、叶、果实的任一果实的任一N Ndffdff N Ndff dff=a ap p/a af f100%100%（设（设N N素来源于土壤素来源于土壤和肥料二方面）和肥料二方面）（3 3）afaf：肥料：肥料N N的原子百分超（或动

22、物饲料的原子百分超（或动物饲料N N的原的原子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。上片解释见第五章第37片同位素稀释法4 4、植物从土壤中摄取、植物从土壤中摄取N N的的%（Percentage Percentage of in the plant tissue derived from of in the plant tissue derived from the soilthe soil）:N Ndfsdfs N Ndfsdfs =1-N=1-Ndffdff (4)(4)5 5、植物中来自肥料的、植物中来自肥料的N N量量:N Npfpf N Np

23、fpf=植物总植物总N N量量a ap p/a af f （5 5）N Npfpf+N+Npsps=植物中总植物中总N N量（已在定量（已在定N N中测定中测定,K K氏定氏定N N法）設总法）設总N N来源于来源于土壤土壤和和肥料，肥料，则：则：6.6.植物中来自土壤植物中来自土壤N N的量：的量：N Npsps N Npsps=总总N-NN-Np pf f (6)(6)7.7.N N素利用率：素利用率：R R=N=Np pf f/N/Nf f100%(7)100%(7)N Nf f：施入纯：施入纯N N的总量的总量 8.8.土壤土壤A A值：值：A A值值 =N=Ndfsdfs/N/Ndf

24、fdffN Nf f (Kg/(Kg/公顷公顷)（8 8）A A值：值：表示土壤有效供应表示土壤有效供应N N素量素量(用用A A值可以解释值可以解释为什么为什么某种土壤某种土壤适合于种植适合于种植某种植物某种植物)。(来自：来自：A A值值/N/Ndfsdfs=N=Nf f/N/Ndffdff)9 9、N N素回收率：素回收率：R R回回 =已检出的已检出的N Nf f量量 /N/Nf f100%(9)100%(9)10 10、N N素损失率：素损失率：R R失失 =100%-R=100%-R回回 (10)(10)以上公式适用以上公式适用3232P P等放射性物质（以比强为单位）等放射性物质

25、（以比强为单位）等计算。等计算。练习题：练习题：蕃茄实验地中施用蕃茄实验地中施用1515N-N-尿素纯尿素纯N20Kg/N20Kg/亩，收获后测得植物含亩，收获后测得植物含N N量为量为30Kg/30Kg/亩，植物样品的亩，植物样品的1515N N丰度为丰度为0.67%0.67%，1515N-N-尿素的尿素的1515N N丰度为丰度为1.37%1.37%，设自然丰度为设自然丰度为0.37%0.37%，尿素的含，尿素的含N N量为量为40%40%。求：求：1 1、每亩施入尿素量？、每亩施入尿素量？2 2、肥料、肥料N N素的利用率？素的利用率？3.A3.A值值?解：解：ap=0.67-0.37=

26、0.3%ap=0.67-0.37=0.3%af=1.37-0.37=1.0%af=1.37-0.37=1.0%Ndff=ap/af=0.3/1.0=30%Ndff=ap/af=0.3/1.0=30%Npf=Np Npf=NpNdff=30Kg/Ndff=30Kg/亩亩30%=9Kg/30%=9Kg/亩亩 施入尿素量：施入尿素量：W=20/40%=W=20/40%=80Kg/80Kg/亩亩 肥料肥料N N素利用率：素利用率：R=Npf/Nf=9/20=R=Npf/Nf=9/20=45%45%A A值值=Ndfs/Ndff=Ndfs/NdffNf=70%/30%Nf=70%/30%20Kg/20K

27、g/亩亩=46.7Kg/46.7Kg/亩亩（土壤中可（土壤中可供蕃茄生长的每亩有效供蕃茄生长的每亩有效N-N-当然不是全部被吸收当然不是全部被吸收,A,A值愈大说明土值愈大说明土壤的供壤的供N N能力愈强）能力愈强）下列研究方法：下列研究方法：1.测根瘤数目和干物质产量。早、有无？测根瘤数目和干物质产量。早、有无？2.氮素平衡法。十分烦琐。氮素平衡法。十分烦琐。3.比较固比较固N作物和非固作物和非固N作物总作物总N量差异。量差异。4.4.乙炔还原法。简单、灵敏。乙炔还原法。简单、灵敏。5.5.乙炔还原成乙烯，存在转换因子（乙炔还原成乙烯，存在转换因子（3个）。个）。1515N N示踪与生物固氮

28、示踪与生物固氮(以下各方法简讲以下各方法简讲)工业固氮（工业固氮（Haber-BoschHaber-Bosch反应）：反应）：N N2 2+3H+3H2 2 催化催化剂剂/45/45，200200在气压在气压 2NH2NH3 3生物固氮：生物固氮：N N2 2+6H+6H+xATP 6e+xATP 6e-/固氮酶固氮酶 2NH3+xADP+xPi 6.同位素法：同位素法：15N2还原法还原法（Burris,1941）:充充15N2密室进行密室进行 NdfA=a样样/a气气100%固氮量固氮量=NdfA总总N N量量同同位位素稀释法素稀释法（J J、O O、LeggLegg等，等，1975197

29、5），），1515N N施入土壤施入土壤 NdfA=1-NdfA=1-a a固固/a a非非A AN N值法值法（M M、FriedFried等，等，19751975），田间种固），田间种固N N、非固、非固N N NdfA=(As+Afix-As)NdfA=(As+Afix-As)NdfF/AfNdfF/Af As As、AfAf、AfixAfix分别代表土壤、肥料、大豆有效分别代表土壤、肥料、大豆有效N N量。量。NdfF:NdfF:来自肥料来自肥料N N素的比例。素的比例。八、八、1313C C示踪法示踪法1 1样品的制备：样品的制备：（1 1）样品碳转化为）样品碳转化为BaCOBaCO

30、3 3：干氧化法：干氧化法（PreglPregl）:如上图如上图 湿 氧 化 法湿 氧 化 法（Weinhouse 1948Weinhouse 1948）(2(2）BaCOBaCO3 3COCO2 2转化：转化：BaCOBaCO3 3+0.5%HCl:+0.5%HCl:饱和饱和NaCl(1:4)(NaCl(1:4)(真空、冷却真空、冷却)2 2测量：测量：COCO2 2在质谱中经电子轰击产生多在质谱中经电子轰击产生多种分子离子和原子离子。种分子离子和原子离子。1313C%=1/R+1C%=1/R+1100%R=45/44100%R=45/44其中：其中：4545示示（1313C C1616O

31、O1616O O）+和和（1212C C1616O O1717O O）+，4444示示 1212C C1616O O1616OO+（m/em/e）,（1212C C1616O O1717O O）+可用校正峰解决。可用校正峰解决。九九.1818O O示踪法：示踪法：样品制备：也是转化成样品制备：也是转化成COCO2 2，很少用，很少用O O2 2、N N2 2O O2 2、NONO2 2。如：平衡法：如：平衡法：H H2 21818O+CO+C1616O O2 2=H=H2 21616O+CO+C1818O O2 2 碳酸盐与碳酸盐与酸反应，直接放出酸反应，直接放出C C1818O O2 2。硅

32、酸盐（。硅酸盐（20002000真空真空炉）炉）1818O O2 2和和C C反应成反应成C C1818O O2 2，1 1：1HgCl:Hg1HgCl:Hg（CNCN）2 2氧化有机样品（氧化有机样品（Aubar等等1955）测定：记录测定：记录44（1212C C1616O O1616O O）+和和46461212C C1616O O1818OO+离子离子流强度：流强度：1818O%O%=1/2R+1100%R=44/46有时也取：有时也取：R=32/34（O2样品）样品）R=28/30 （1212C C1616O O+）（）（1212C C1818O O）+十十.2 2H H示踪法：示踪法：样品制备：有机态样品制备：有机态HHHH2 2O1000O1000锡丝锡丝HH2 2或直接把或直接把H H2 2O O引入质谱（低丰度不宜）引入质谱（低丰度不宜）测定：记录测定：记录33（HDHD）+和和22（H H2 2）+2 2H%=1/2R+1H%=1/2R+1100%R=2/3100%R=2/3 7