第五章目的基因与克隆载体的体外重组新课件.ppt

1、第五章第五章 目的基因与载体的目的基因与载体的 体外重组体外重组基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切接接转转增增检检连接时考虑因素连接时考虑因素实验步骤尽量简单易行实验步骤尽量简单易行连接形成的节点序列应能被重新切割连接形成的节点序列应能被重新切割对转录、转译中密码阅读不发生干扰对转录、转译中密码阅读不发生干扰u粘性末端连接粘性末端连接u平末端连接平末端连接u末端延伸连接：末端延伸连接：连接方式连接方式同聚物加尾同聚物加尾加人工接头加人工接头加加DNA衔接物衔接物粘性末端连接粘性末端连接单酶切产生的粘性末端的连接单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）（同种酶）5 5GAATTCCTTAAGG

2、AATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG5 GCTTAA 55 AATTCG5 5 GAATTCCTTAAG5 EcoRI粘性末端连接粘性末端连接单酶切产生的粘性末端的连接单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶）（同尾酶）BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGAT

3、CCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclITGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT粘性末端连接粘性末端连接双酶切产生的粘性末端的连接双酶切产生的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoRI5GCCTGAAATTCG5 退火退火GCCTGAAATTCG5 GCTTAA 5 GACTTAT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GGACTTCCTGAA5 GCTTAA 55 GACTTA5 5 GAATTCCTTAAGE

4、coRIGGACTTCCTGAABamBam平末端连接平末端连接HpaI5 5GTTAACCAATTGGTTAACCAATTG5GTTCAA AACTTG5 5 CCCGGG5 GGG CCC3 T4-DNA ligaseCCCAACGGGTTG5 5GTTGGGCAACCC5 CCCGGGGGGCCC5 StuI3 平末端连接平末端连接-不同粘性末端的平端连接不同粘性末端的平端连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5

5、CTGCAGGACGTC5 PstI3 T4-DNA pol切平切平5 CG5 GCKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC粘性末端的更换粘性末端的更换BamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseKlenow补平补平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCCTGCAGGATCCCCTAGGACGTCCTAGG5 5PstICTGCAGGACGTCPstI linker末端转移酶（末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化）：在没

6、有模板存在的条件下，能催化dNTP 随机加于随机加于DNA分子的分子的3-OH端端5 p3 HOOH 3 p 5 TDTMg2+dATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p3 HOp 5 同聚物尾巴同聚物尾巴 Poly（dA）末端延伸连接末端延伸连接同聚物加尾同聚物加尾C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3 5

7、 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT末端延伸连接末端延伸连接同聚物加尾同聚物加尾 （平齐末端）平齐末端）末端延伸连接末端延伸连接同聚物加尾同聚物加尾 （33突出末端）突出末端）CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火Pst IPst IC3CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG

8、3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I末端延伸连接末端延伸连接同聚物加尾同聚物加尾 （55突

9、出末端）突出末端）5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5Klenow补平补平Klenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCC CCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCC

10、CCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火退火BamH IBamH IEcoR IBamH I人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面 带有一带有一 至数个限制酶识别位点至数个限制酶识别位点作用：加至待克隆的平末端作用：加至待克隆的平末端DNA片段两侧，酶切后片段两侧，酶切后 产生粘性末端产生粘性末端末端延伸连接末端延伸连接人工接头加尾人工接头加尾CCGAATTCGG5 GGCTTAAGCC5 EcoR I末端延伸连接末端延伸连接人工接头加尾人工接头加尾55 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA

11、 ligase5 5T4-DNA ligase5CCGAATTCGG5 GGCTTAAGCCEcoR ICCGGGCTTAAAATTCGGGCCGAATTCGGCTTAAGCCCCGAATTCGGCTTAAG退火退火EcoR IEcoR IEcoR ICCGAATTCGGGGCTTAAGCCDNADNA衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端 （与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘（与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘 性末端（与载体粘端连接）性末端（与载体粘端连接）末端延伸连接末端延伸连接DNADNA衔接物加尾衔接物加尾CCG5

12、 GGCTTAA5 EcoR I AATTCGG5 GCC5 EcoR I重组率重组率重组率的定义：重组率的定义：重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数（在常规实验条件下，重组率一般为25-75%）重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。重组率重组率提高重组率的方法：提高重组率的方法：提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1 10:1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火退火5 G-A-A

13、-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸酶碱性磷酸酶5 GAATTCCTTAAG5 重组率重组率提高重组率的方法：提高重组率的方法：人工构建粘性末端：CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3 C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火C3CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenow