第二章-蛋白质的定性定量分析课件.ppt
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- 第二 蛋白质 定性 定量分析 课件
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1、 第二章第二章 蛋白质的定性定量分析蛋白质的定性定量分析 蛋白质定性分析蛋白质定性分析(qualitative analysis)确定样品中是否有蛋白质存在,以及存在确定样品中是否有蛋白质存在,以及存在的是何种蛋白质的是何种蛋白质 蛋白质定量分析蛋白质定量分析(quantitative analysis)确定样品中总蛋白含量,或者某种单一蛋确定样品中总蛋白含量,或者某种单一蛋白成分的含量白成分的含量 蛋白质含量的测定方法蛋白质含量的测定方法(重点掌握)(重点掌握)蛋白质相对分子量测定蛋白质相对分子量测定(SDS-PAGE)等电聚焦电泳等电聚焦电泳(IEF)(一般了解)(一般了解)蛋白质的免疫印
2、迹分析蛋白质的免疫印迹分析(western blot)第一章第一章 蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定基于蛋白质的基于蛋白质的元素组成特点元素组成特点基于蛋白质的基于蛋白质的化学显色反应化学显色反应基于蛋白质的基于蛋白质的光吸收特性光吸收特性 蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近,平均为各种蛋白质的含氮量很接近,平均为16 由于体内的含氮物质以蛋白质为主,因此由于体内的含氮物质以蛋白质为主,因此只要测定生物样品中的含氮量,就可以根据只要测定生物样品中的含氮量,就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量:以下公式推算出蛋白质的大致含量:10
3、0克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%一、紫外光谱一、紫外光谱(A280)吸收法吸收法 这一方法可用来快速检测溶液中是否含有这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰白质的洗脱峰原原 理理 色氨酸、酪氨酸的最色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在大吸收峰在280 nm附近附近 大多数蛋白质含有这两大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基,所以测定种氨基酸残基,所以测定蛋白质溶液蛋白质溶液280 nm的光吸的光吸收值是分析溶液中蛋白质收值是分析溶液中蛋白质含量的
4、快速简便的方法含量的快速简便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收优优 点点 快速快速缺缺 点点 核酸可引起强干扰作用核酸可引起强干扰作用芳香族氨基酸含量差异可以芳香族氨基酸含量差异可以起误差起误差 对蛋白质无破坏性对蛋白质无破坏性 不是严格的定量,适用于测定蛋不是严格的定量,适用于测定蛋 白质粗提液白质粗提液 计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法 蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260注意事项注意事项 石英比色杯石英比色杯 调零所用溶液调零所用溶液 配制标准蛋白所用溶液配制标准蛋白所用溶液 光密度范围光密度范围二、考马斯亮蓝二、考马斯亮蓝G-25
5、0检测法检测法 这是一种迅速、可靠的通过染色法测定这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法溶液中蛋白质含量的方法原原 理理 该法是基于考马斯亮蓝该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色溶液,当与蛋白质结合后,件下,可配成淡红色溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳。蓝色复合物产生蓝色化合物,反应迅速而稳。蓝色复合物在在595 mn波长处具有最大光吸收值,并与溶液波长处具有最大光吸收值,并与溶液中蛋白质浓度成正比,因此可检测中蛋白质浓度成正比,因此可检测5
6、95 mn的光的光吸收值大小计算蛋白的含量吸收值大小计算蛋白的含量所需时间所需时间 10 min优优 点点 快速(反应时间仅需快速(反应时间仅需2 min)敏感,几乎没有蛋白质损失敏感,几乎没有蛋白质损失缺缺 点点 用这种测定方法对蛋白质引起不用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性可逆的变性 对各种纯化蛋白质反应不同对各种纯化蛋白质反应不同计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法注意事项注意事项 反应反应1015 min后开始出现沉淀,后开始出现沉淀,尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀件下易发生沉淀 若选用目的蛋白来做标准曲线或用若选用目的蛋白来做标准
7、曲线或用 另一种方法来校正,所测蛋白浓度另一种方法来校正,所测蛋白浓度 较准确较准确三、三、Lowry检测法检测法 这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用得到广泛应用.原原 理理 首先在碱性溶液中形成铜首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物,然蛋白复合物,然后这一复合物还原磷钼酸后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂磷钨酸试剂(Folin-酚试剂酚试剂),产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色,产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色,这种深蓝色的复合物在这种深蓝色的复合物在745 750 nm处有最大处有最大的吸收峰,颜色的深浅的吸收峰,颜色的深浅(吸收值吸收值)与蛋白质浓度
8、与蛋白质浓度成正比,可根据成正比,可根据750 nm的光吸收值大小计算的光吸收值大小计算蛋白质的含量蛋白质的含量优优 点点 一种可靠的蛋白质定量方法一种可靠的蛋白质定量方法 不同蛋白质之间差别很小不同蛋白质之间差别很小缺缺 点点 某些试剂不稳定某些试剂不稳定 干扰物质多干扰物质多 使蛋白质发生不可逆变性使蛋白质发生不可逆变性计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法注意事项注意事项 在加入试剂在加入试剂30 min后呈色达到饱后呈色达到饱 和,时间延长颜色信号减弱和,时间延长颜色信号减弱 许多干扰物质降低颜色反应许多干扰物质降低颜色反应 高盐浓度可引起沉淀高盐浓度可引起沉淀四、四、BCA(二喹啉甲
9、酸二喹啉甲酸)检测法检测法 这是近年来新研制的一种改进的这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法测定法原原 理理 在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2生成络合物,同时将生成络合物,同时将Cu2还原成还原成Cu。而而BCA试剂可敏感特异地与试剂可敏感特异地与Cu结合,形成结合,形成稳定的有颜色的复合物,在稳定的有颜色的复合物,在562 nm处有高的处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量优优 点点 检测敏感性高检测敏感性高缺缺 点点 蛋
10、白质发生不可逆的变性蛋白质发生不可逆的变性 终产物稳定终产物稳定巯基试剂和去垢剂干扰巯基试剂和去垢剂干扰第二节第二节 蛋白质相对分子量测定蛋白质相对分子量测定分子量测定分子量测定(molecular weight,MW)排阻层析排阻层析沉降平衡超速离心沉降平衡超速离心动态弹性光散射动态弹性光散射孔径梯度电泳孔径梯度电泳质谱质谱(ESI-MS)一、一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量测定蛋白质的相对分子量1.不连续系统原理不连续系统原理2.SDS-PAGE凝胶的制备凝胶的制备制备分离胶制备分离胶制备浓缩胶制备浓缩胶加样加样装板装板电泳电泳卸板并进行凝胶染色卸板并进行凝胶染色3.SDS-PA
11、GE基本原理基本原理 SDS 影响迁移率的因素影响迁移率的因素l 十二烷基十二烷基硫硫酸钠酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate)l 十二烷基十二烷基磺磺酸钠酸钠(Sodium Dodecyl Sulfonate)SDS作用:作用:与蛋白牢固结合,当其浓度大与蛋白牢固结合,当其浓度大于于1 mmol/L 时,时,SDS与蛋白质的结合比例为与蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质,由于十二烷基硫酸根带蛋白质,由于十二烷基硫酸根带负电荷,使得样品中各种蛋白质与负电荷,使得样品中各种蛋白质与SDS形成形成的的SDS-蛋白质复合物都带有蛋白质复合物都带有相同密度的负电相同密度的负
12、电荷荷,掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异,掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异 SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物分子构型分子构型也几乎相同也几乎相同(雪茄雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物烟形的长椭圆棒状的复合物),而且具有相同的,而且具有相同的荷质比荷质比,因此在,因此在SDS-PAGE中,中,SDS-蛋白质复蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关,而不再合物的电泳迁移率只与其分子量有关,而不再受所带电荷及分子形状的影响,且在一定条件受所带电荷及分子形状的影响,且在一定条件下,迁移率与分子量呈对数线性关系下,迁移率与分子量呈对数线性关系 Watch SDS-PAGE原理原理4.SDS-PAGE测定分
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