第九节-肉毒梭菌课件.ppt

1、第九节、肉毒梭状芽孢杆菌检验第九节、肉毒梭状芽孢杆菌检验一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性1、形态与染色、形态与染色 肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性(老龄菌是阴性），约为老龄菌是阴性），约为41m的大杆菌，的大杆菌，多单在，偶见成多单在，偶见成双或短链，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为双或短链，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，大于菌体宽度，位于次极端，使菌体呈匙形或网球卵圆形，大于菌体宽度，位于次极端，使菌体呈匙形或网球拍状，偶有位于中央，常见很多游离芽胞。拍状，偶有位于

2、中央，常见很多游离芽胞。有有48根周生鞭毛，根周生鞭毛，运动迟缓，运动迟缓，无荚膜。无荚膜。2、培养特性、培养特性最严格的厌氧菌最严格的厌氧菌生长最适温度：生长最适温度：28 37 ：pH为为6.87.6，产毒的最适，产毒的最适pH为为7.8 8.2。产毒培养温度：不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。产毒培养温度：不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。C、D型型温度高些为宜，温度高些为宜，35 培养培养3d即可，而即可，而E型菌低温度长时间培养效果较好。型菌低温度长时间培养效果较好。对营养要求不高对营养要求不高：在普通培养基上都能生长。：在普通培养基上都能生长。肉毒梭状芽孢杆菌菌落肉毒梭状芽

3、孢杆菌菌落 在固体培养基表面上，形成类圆形，在固体培养基表面上，形成类圆形，边缘不整齐，约边缘不整齐，约3毫米左右的菌落。菌落毫米左右的菌落。菌落半透明，表面一般比较光滑也有的呈颗粒半透明，表面一般比较光滑也有的呈颗粒状，界线不明显，向外扩散。呈绒毛网状，状，界线不明显，向外扩散。呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。常常扩散成菌苔。2、培养特性、培养特性在含有肉渣的液体或者半流动培养基中，肉毒梭菌生长旺盛且产生大在含有肉渣的液体或者半流动培养基中，肉毒梭菌生长旺盛且产生大量气体，量气体，A、B、F三型表面浑浊，底部有粉状和颗粒状沉淀，并能消化三型表面浑浊，底部有粉状和颗粒状沉淀，并能消化肉块，变黑有臭

4、味；而肉块，变黑有臭味；而C、D、E三型表明清亮，絮片状生长，粘贴于管三型表明清亮，絮片状生长，粘贴于管壁。壁。肉毒梭状芽孢杆菌菌落肉毒梭状芽孢杆菌菌落 在葡萄糖鲜血琼脂平板上，菌落较小，扁平，颗粒状。中央低在葡萄糖鲜血琼脂平板上，菌落较小，扁平，颗粒状。中央低落，边缘不规则，有的菌落还有大的溶血环。落，边缘不规则，有的菌落还有大的溶血环。在卵黄琼脂平板上生长，菌落及其培养基周围表面覆盖着特有在卵黄琼脂平板上生长，菌落及其培养基周围表面覆盖着特有的彩虹样薄层，但的彩虹样薄层，但G型没有。型没有。u肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株间肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株

5、间的差异。的差异。3、肉毒梭菌的生化特性、肉毒梭菌的生化特性 表表1 各型肉毒梭菌的生化反应各型肉毒梭菌的生化反应二、二、肉毒梭菌的致病性肉毒梭菌的致病性 肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋白），根据肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋白），根据毒素的抗原特异性将其分为毒素的抗原特异性将其分为A、B、C（1、2）、D、E、F、G七个型别。与毒素型别相对应，肉毒梭菌也分为同样的七个七个型别。与毒素型别相对应，肉毒梭菌也分为同样的七个型别。其中型别。其中A、B、E、F四型毒素对人有不同程度的致病性。四型毒素对人有不同程度的致病性。A A型毒素经型毒素经60602 2分钟加热，差不多能被完

6、全破坏，而分钟加热，差不多能被完全破坏，而B B、E E二型毒素要经二型毒素要经70702 2分钟才能被破坏；分钟才能被破坏；C C、D D二型毒素对热的抵二型毒素对热的抵抗更大些；抗更大些；C C型毒素要经过型毒素要经过90902 2分钟加热才能完全破坏，不论分钟加热才能完全破坏，不论如何，只要煮沸如何，只要煮沸1 1分钟或分钟或7575加热加热5 51010分钟，毒素都能被完全分钟，毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性

7、能被胰酶激活和加强。致病机理致病机理 肉毒毒素是一种神经麻痹毒素，主要抑制神经末梢释放乙肉毒毒素是一种神经麻痹毒素，主要抑制神经末梢释放乙酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹导致死亡。酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹导致死亡。肉毒毒素的毒性极强，是目前已知在天然毒素和合成毒剂肉毒毒素的毒性极强，是目前已知在天然毒素和合成毒剂中毒性最强的生物毒素，据称，精制毒素中毒性最强的生物毒素，据称，精制毒素1克能杀死克能杀死400万吨小万吨小白鼠，一个人的致死量大概白鼠，一个人的致死量大概1微克左右。微克左右。肉毒中毒一年四季均可发生。美国以罐头发生中毒较多，肉毒中毒一年四季均可发生。美国

8、以罐头发生中毒较多，日本以水产品较多；我国以发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、日本以水产品较多；我国以发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等）发生中毒较多。豆豉等）发生中毒较多。三、检验方法三、检验方法1、检验标准：、检验标准：GB 4789.12-20032、培养基和试剂、培养基和试剂培养基：培养基：庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。试剂：试剂：肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力1:250）、革兰）、革兰氏染色液。氏染色液。另需实验动物（小白鼠）。另需实验动物（小白鼠）。3、检验程序检验程序检检 样样毒素检测毒

9、素检测增菌、产毒培养增菌、产毒培养30，5 d报告报告（一）（一）毒素检测毒素检测报告（二）报告（二）分离培养分离培养培养检查培养检查毒素检测毒素检测报告（三）报告（三）增菌产毒培养增菌产毒培养30，5 d 观察生长性状，观察生长性状，染色镜检染色镜检观察菌落性状观察菌落性状染色镜检染色镜检报告报告(一一)：检样中有无肉毒毒素以检样中有无肉毒毒素以及有何型肉毒毒素。及有何型肉毒毒素。(如仅为了肉毒中如仅为了肉毒中毒诊断，即可结束检验毒诊断，即可结束检验)报告报告(二二)：对增菌产毒培养物，一对增菌产毒培养物，一方面做生长特性观察，同时检测肉毒方面做生长特性观察，同时检测肉毒毒素。报告检样中有无

10、肉毒梭菌以及毒素。报告检样中有无肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌。（有些样品如土壤、有何型肉毒梭菌。（有些样品如土壤、泥沙等基本上不可能含有毒素，则应泥沙等基本上不可能含有毒素，则应从培养着手）从培养着手）报告报告(三三)：欲获纯菌株，可用增菌欲获纯菌株，可用增菌产毒培养物进行分离培养，对所得纯产毒培养物进行分离培养，对所得纯菌株进行形态、培养特性等观察及毒菌株进行形态、培养特性等观察及毒素检测，其结果可证明所得纯菌为何素检测，其结果可证明所得纯菌为何型肉毒梭菌。（一般情况下，没有必型肉毒梭菌。（一般情况下，没有必要从检样中分离纯的菌株，但研究或要从检样中分离纯的菌株，但研究或特殊需要例外）特殊需要

11、例外）（1）、肉毒毒素检测）、肉毒毒素检测注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24 h内发病、死亡。内发病、死亡。液态或固体（明胶磷酸盐缓冲液）样品经过适当处理后离心，取上清液实验液态或固体（明胶磷酸盐缓冲液）样品经过适当处理后离心，取上清液实验 上清液及其胰酶激活处理液上清液及其胰酶激活处理液 分别进行小白鼠腹腔注射，各分别进行小白鼠腹腔注射，各3只，每只只，每只0.5 mL，观察，观察4 d 确证试验确证试验毒力测定毒力测定 定型试验定型试验 取庖肉培养基三支，煮沸取庖肉培养基三支，煮沸10min15min，做如下处理：，做如下处理：

12、第一支：第一支：急速冷却，接种检样均质液急速冷却，接种检样均质液1 mL2 mL；第二支：第二支：冷却至冷却至60，接种检样，继续于，接种检样，继续于60保温保温10 min，急速冷却；，急速冷却；第三支：第三支：接种检样，继续煮沸加热接种检样，继续煮沸加热10 min，急速冷却。，急速冷却。以上以上3支试管于支试管于30厌氧培养厌氧培养5d，若无生长，可再培养，若无生长，可再培养10d。培养到期，。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同上，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同上，阳性阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。结果证明检样中有肉毒梭菌

13、存在。（2 2）、肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）、肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，的加热处理）接种卵黄琼脂平板，3535厌氧培养厌氧培养48 h48 h。肉毒梭菌在卵黄。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样(或珍珠或珍珠层样层样)薄层薄层，但，但G型菌无此现象。型菌无此现象。根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于根据菌落形态及菌体形态挑取可

14、疑菌落，接种庖肉培养基，于3030培养培养5d5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。（1）毒素检测：试验方法同上。）毒素检测：试验方法同上。（2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成两份，分别在，分成两份，分别在35的需氧和厌氧的需氧和厌氧条件下培养条件下培养48 h，观察生长情况及菌落形，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而在需态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而在需氧条件下不生长。氧条件下不生长。4、结果报告、结果报告报告报告(一一)：检样含有某型肉毒毒素。：检样含有某型肉毒毒素。报告报告(二二)：检样含有某型肉毒梭菌。：检样含有某型肉毒梭菌。报告报告(三三)：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。的主要依据。