第七章重组体克隆的筛选和鉴定总结课件.ppt

1、第七章第七章 重组体克隆的筛选和鉴定重组体克隆的筛选和鉴定一、抗药性筛选法一、抗药性筛选法载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性基因基因。第一节第一节 利用遗传标记的表型特征筛选利用遗传标记的表型特征筛选1.原理：原理：利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子如：如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因质粒上有两个抗菌素性基因:Tetr和和Ampr。（1）四环素：）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR3222.pBR322抗菌素标记选择抗菌素标记选择产生产生-内酰胺酶，使

2、内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：3.3.选择过程：选择过程：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四，导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸平板培养基选择重组克隆。平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生

3、长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基（2 2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。指示液选择。如：亮氨酸（如：亮氨酸（Leu)缺陷菌在缺陷菌在无无Leu培养基中不生长，培养基中不生长，当当含含Leu外源基因在此缺陷菌

4、中外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。性克隆。二、营养缺陷型筛选法二、营养缺陷型筛选法载体上携带有某些营养成分的生物合成基因，载体上携带有某些营养成分的生物合成基因，而受体细胞基因突变不能合成生命必须的营而受体细胞基因突变不能合成生命必须的营养物质。养物质。三、显色筛选法三、显色筛选法载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选粒粒pUC18携带的携带的lacZ基因（蓝色反应）基因（蓝色反应）利用有插入片段的重组载体分子量比野利用有插入

5、片段的重组载体分子量比野生型载体分子量大。生型载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。第二节第二节 根据重组子的结构特征筛选根据重组子的结构特征筛选 重组克隆重组克隆载载体体二、二、限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法1.原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用或用合适的内切酶切下插

6、入片断，再用酶切这个片断，电泳后比较结果是否符酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。合预计的结果。区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子:用用BamHI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段电泳观察酶解产物片段重组子：重组子：2.7kb+4.0kb非重组子：非重组子：2.7kb如果外源如果外源DNA片段也是片段也是2.7 kb，最好选用单一切口的酶，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子长度来鉴定其是否为重组子筛选过程三、三、PCRPCR扩增检测法扩增检测法1.原理原理PCR能在模板上扩增出预期能在模板上扩增出预

7、期DNA片断。片断。2.过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。1）.核酸核酸杂交杂交四、四、核酸分子杂交检测核酸分子杂交检测法法 1、原理：、原理：重组克隆与探针杂交。重组克隆与探针杂交。3）.识别标记识别标记32P（1）放射性同位素）放射性同位素2）.检测用的探针检测用的探针与外源与外源DNA插入片断互补的序列。插入片断互补的序列。（2）非放

8、射性标记）非放射性标记荧光素荧光素2 2、菌落噬菌斑原位杂交筛选、菌落噬菌斑原位杂交筛选特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品。样品。3.Southern blotting从细胞中提取从细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探（或质粒载体），再用探针杂交。针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。交，在底片上曝光显示。Southern blot 筛选结果酶切前酶切前酶切后酶切后插入片断插入片断载体载体4.N

9、orthern blotting用用DNA（或（或RNA）探针检测探针检测RNA样样品。品。主要检测插入片主要检测插入片断是否被转录。断是否被转录。从宿主细胞中提从宿主细胞中提取取RNA，再用探，再用探针杂交。针杂交。利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：的性质可分为几种作用方式：第三节第三节 免疫化学检测免疫化学检测法法 1.抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。对表达产物的

10、检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交”待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗2.2.放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程3.Broome-Gilbert3.Broome-Gilbert双位点检测法双位点检测法质粒基因

11、质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白检测融合蛋白。检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。固相支固相支持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底片曝光发光，底片曝光二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成

12、菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”。1.原理原理抗原抗原抗体凝集反应。抗体凝集反应。检测分泌型产物。检测分泌型产物。2.方法方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISAELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1.原理：原理：利用利用一抗一抗（Primary antibody）与）与目目标分子标分子的特异结合，的特异结合，二抗二抗（secondary antibody）与）与一抗一抗

13、的特异性结合，二的特异性结合，二抗上携带一种酶能催化一种反应将无抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为色的底物转变为有色的物质有色的物质（或发（或发光），再通过比色测定有色物质的含光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子量（或光强度），从而推测目标分子的含量。的含量。待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶待测基因待测基因产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶2.ELISA2.ELISA检测的一般步骤检测的一般步骤（1）固定样品）固定样品将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（

14、microtiter plate）的孔中，干燥后）的孔中，干燥后就被固定在孔底。就被固定在孔底。（孔底）（孔底）加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合）一抗结合一抗一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。酶、脲酶等）。（3）二抗结合）二抗结合二抗二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。化反应转变成有色物质（或

15、发光）。（4）显色反应）显色反应在特殊的分光光度仪（在特殊的分光光度仪（酶标仪酶标仪）上比色，打）上比色，打印出结果。印出结果。（5）比色）比色3.ELISA3.ELISA的局限性的局限性有效，但准确性稍差（有效，但准确性稍差（主要取决于一抗主要取决于一抗的特异性的特异性）。）。必须与其他方法一起综合考虑。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）。）。四、免疫印迹（四、免疫印迹（western blottingwestern blotting）法）法1.1.原理：原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方在蛋白质凝胶电泳以后，用

16、转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。结合，使蛋白质带上负电荷。SDS:（SDS-PAGE）：）：聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）：）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下线性在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主移动，移动的速率主要

17、取决于其要取决于其分子量大分子量大小小（链的长短），从（链的长短），从而把不同分子量的肽而把不同分子量的肽链分开。链分开。电泳电泳buffer电泳电泳buffer蛋白质电泳的分子量蛋白质电泳的分子量标准标准已知分子量的蛋白质已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。白质提供分子量估计。商品化供应商品化供应Da道尔顿道尔顿(质量单位质量单位,等于等于一氧原子质量的十六分一氧原子质量的十六分之一。之一。一克约为一克约为6 610102323道尔顿道尔顿Dalton凝胶中的蛋白质染色：凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：考马斯亮蓝：灵敏

18、度底、只能检出灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可带，但可褪色回收。褪色回收。硝酸银：硝酸银：灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色。）转到膜上进行染色。1）直接染色）直接染色（2）Western blotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、膜、中性尼龙膜等）。中性尼龙膜等）。Western（转膜）（转膜）胶里的蛋白质带在电胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。到正极一侧的膜上。膜膜胶胶蛋白蛋白Western装置 Blo

19、tting原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧化物酶化物酶底物底物产物，产物，并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸的底物浸泡膜。泡膜。6）暗室里曝光，冲洗）暗室里曝光，冲洗胶片。胶片。Blotting Blotting过程过程结果结果多克隆抗体多克隆抗体Blotting的的结果结果单抗单抗blotting结果结果