第8章层析分离课件.ppt

1、第8章 层析分离 知识点：知识点：色层分离法的分类及其概念，柱层析技术，吸附层析技术，离交层析技术，生物亲和层析技术，分配层析技术，凝胶过滤技术，电泳技术，薄板层析技术。重点：重点：上述各技术的原理、操作方式、操作过程、所用装置和材料的选择、适用范围，能够灵活熟练地运用这些技术。难点：难点：常用层析法的分类及其合理选用。目录 1 层析法概述 2 柱层析 3 纸层析 4 薄层层析 5 吸附层析 6 分配层析 7 凝胶过滤 8 电泳法 9 毛细管电泳 10高效液相色谱1 层析法概述1.1引言1.2层析的发展史1.3层析的基本原理及基本概念1.4层析的分类1.5层析剂1.1 引言p层析原理p色谱（层

2、析）法应用范围p色谱技术的提出色谱分离图示 1.2 层析的发展史年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用1906 Tswett 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念 1931 Kuhn,Lederer 用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Taylor Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941 Martin,Synge 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952Martin,James 从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956Van Deemter提出

3、色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1965Giddings 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975 Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981 Jorgenson创立了毛细管电泳法。1.3 层析基本概念 层析 展开（development）洗脱液(eluate)色谱(Chromatograph)。分配系数 洗脱体积：外体积：内体积：正相层析：反相层析：1.4 层析分类 分类原则分类原则类型特征据溶质分子与固定相相互作用的机理不同吸附色

4、谱离子交换色谱疏水作用层金属螯合色谱共价作用色谱分配色谱凝胶过滤亲和色谱吸附力不同各物质与固定相之间的离子交换能力的不同各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同各物质在两液相间的分配系数不同各物质的分子大小或形状不同利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同据实验技术 低压色谱中压色谱高压色谱电泳操作压力小于0.5 MPa操作压力在0.55 MPa之间操作压力在540 MPa之间溶质分子在电场中的移动速度不同据固定相的形状不同柱色谱纸色谱薄层色谱固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中固定相为以氢键与纤维素羟基结

5、合的水固定相在玻璃平板上铺成薄层据流动相的物态不同 气相色谱液相色谱超临界流体色谱流动相为气体流动相为液态流动相为液态按操作方式不同 迎头法顶替法洗脱法将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流出，但其它各组分都不能达到分离。利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。吸附色谱与其它色谱法的异同点 类型机理优点缺点适用范围吸附色谱化学、物理吸附操作简便易受离

6、子干扰各种生物大分子的分离、脱色、和去热源凝胶过滤分子筛的排阻效应分辨力高，不会引起变性各种凝胶介质昂贵，处理量有限制分子量有明显差别的可溶性生物大分子分配色谱溶质在固定相和流动相中分配系数的差异分辨力高，重复性较好，能分离微量物质影响因子多，上样量太小用于各种生物大分子的分析鉴定亲和色谱亲和色谱生物大分子与配体之间有特殊亲和力分辨力很高 一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大各种生物大分子聚焦色谱等电点和离子交换作用分辨力高进口试制昂贵蛋白质和酶1.4 层析的分类 根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类凝胶过滤法分配层析法离子交换色层分离法吸附层析法疏水作用色层分离法金属螯合色层分离

7、法共价作用色层分离法 根据实验技术的分类低压层析技术中压层析技术高压层析技术电泳法操作压力在0.5MPa-5MPa之间操作压力在5Mpa-40MPa之间操作压力小于0.5MPa靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离 根据固定相的形状不同的分类：柱层析法纸层析法薄层层析法 根据流动相的物态不同的分类 汽相层析法液相层析法液相层析法 操作方式不同的分类迎头法顶替法洗脱分析法1.5 层析剂种类氧化铝硅胶活性炭琼脂糖 纤维素2 柱层析法柱色谱法对色谱介质材料的要求常用柱色谱介质的分类柱层析系统的组成柱色谱洗脱方法常用柱色谱介质的分类无机物色谱介质包括：氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型和晶

8、型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。聚合物色谱介质有：琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等。柱色谱洗脱方法 洗脱一般有三种方法：恒定洗脱法：逐次洗脱法：梯度洗脱法：梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。浓度梯度制造器柱色谱系统的组成 色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成(图2)。柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成：A 蠕动泵B 层析柱C 装柱D 加试样E 洗脱F 检测器G 部分收集器柱层析系统的组成柱层析装置图柱层析装置图 缓缓冲冲液液管管柱柱梯梯度度制制造造器器监监视视器器记录记录器分分划划收收集集器器(1)(2)

9、泵泵(3)(4)(5)adaptorreservoir胶胶体体装装填填胶胶体体A3 纸层析法3.1 基本原理3.2 操作方法3.3 操作步骤小实验1234 1234甘氨酸半胱氨酸组氨酸缬氨酸纸层析小实验动画演示滤纸的选用型号 标重(g/m2)厚度(mm)吸水性 灰分(%)性能 1900.17150-120 0.08快速 2900.16120-910.08中速 3900.1590-600.08慢速 41800.34151-121 0.08快速 51800.32120-910.08中速 61800.3090-600.08慢速 4 薄层层析法4.1 薄层层析原理4.2 吸附剂及展开剂4.3 特殊薄层

10、4.4 薄层层析操作要点4.5 定性分析4.6 定量分析4.7 薄层层析应用4.4 薄层层析操作要点铺板点样点样量展开显色注：本部分以操作要点注意事项为主，具体过程参见咖啡因的分离分析（动画演示）Do you understand?薄层层析应用示例薄层层析应用示例 咖啡因的分离分析咖啡因的分离分析 （动画演示动画演示）图1 芍药甙薄层层析扫描图 图2 丹皮酚薄层层析扫描图5 吸附层析法5.1 吸附层析定义及原理5.2 吸附色层与其他色层分离法的异同点5.3 吸附层析的分类5.4 无机吸附色层分离法5.5 疏水作用层析（HIC）5.6 金属螯合层析5.7 共价作用层析法5.8 离子交换层析法5.

11、9 卡那霉素A、B组分分离纯化典型实例吸附色层与其他色层分离法的异同点吸附层析化学、物理吸附操作简便易受离子干扰各种生物大分子的分离、脱色、和去热源凝胶层析分子筛的排阻效应分辨力高，不会引起变性各种凝胶介质昂贵，处理量有限制分子量有明显差别的可溶性生物大分子分配层析溶质在固定相和流动相中分配系数的差异分辨力高，重复性较好，能分离微量物质影响因子多，上样量太小用于各种生物大分子的分析鉴定亲和层析亲和层析生物大分子与配体之间有特殊亲和力分辨力很高 一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大各种生物大分子聚焦层析等电点和离子交换作用分辨力高进口试制昂贵蛋白质和酶吸附层析的分类 无机材料的吸附色层分离法

12、 离子交换色层分离法 疏水作用色层分离法 共价作用色层分离法 金属螯合作用色层分离法等 作业名词解释：名词解释：梯度洗脱法、共价作用层析、免疫亲和层析、层析剂的排阻效应、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤：2.2.填填 空：空：1)凝胶过滤主要应用于，和。凝胶过滤时先自柱中流出，凝胶电泳中运动速度更快，凝胶电泳是基于和双重机理，常用的凝胶剂有和。2)共价作用层析主要依靠的原理，吸附层析是基于的机理，蛋白质和离子交换剂的结合是通过而结合，离子交换层析剂有和sephadex G-15 表示，硅胶G不能用显色剂检测，硅胶GH254可用于分离而无需显色处理。3.3.是非判断题：是非判断题：请对以下论述进行是非判断，对的打，错的打，并予以改正。1)凝胶电泳和凝胶过滤的机理是一样的。2)sephadex G-15 表示水滞留量为1.5克/克干胶。3)硅胶G能用浓硫酸显色剂检测。4)凝胶过滤常用的凝胶剂有葡聚糖和琼脂糖两种。5)梯度洗脱法能减轻层析时的脱尾现象。