蛋白质的分离纯化和表征课件.ppt

1、第第7章蛋白质的分离、纯化和章蛋白质的分离、纯化和表征表征因材施法，有的放矢因材施法，有的放矢蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征讨论n可利用哪些蛋白质的性质进行分可利用哪些蛋白质的性质进行分离与纯化？离与纯化？对蛋白质分子进行的各种研究，要建立在对蛋白对蛋白质分子进行的各种研究，要建立在对蛋白质分子本身的性质（特别是区别于其它生物与质分子本身的性质（特别是区别于其它生物与化学分子的独特的性质）和各种实验手段的原化学分子的独特的性质）和各种实验手段的原理和适用性深入了解的基础上。理和适用性深入了解的基础上。蛋白蛋白质质大分大分子子半透半透膜膜小分小分子子小分小分子子蛋白质的分离、纯

2、化和表征蛋白质的分离、纯化和表征n分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括：用蛋白质之间各种特性的差异，包括：n分子的大小和形状分子的大小和形状n酸碱性质酸碱性质n溶解度溶解度n吸附性质吸附性质n对配体分子的特异生物学亲和力对配体分子的特异生物学亲和力蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征.1.1 蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质7.2 7.2 蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状7.3 7.3 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀7.4 7.4 蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的一般

3、原则7.5 7.5 蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法7.6 7.6 蛋白质的含量测定与纯度鉴定蛋白质的含量测定与纯度鉴定n.1.1 蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质n对某一种蛋白质来说，在某一对某一种蛋白质来说，在某一pHpH，它所带的正，它所带的正电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一一pHpH称为蛋白质的称为蛋白质的等电点等电点。蛋白质胶体颗粒沉淀蛋白质胶体颗粒沉淀沉淀技术沉淀技术蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质n蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下可以发生明显的变化。可以发生明显的

4、变化。n蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。n没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的相等时的pHpH称为称为等离子点等离子点。n7.2 7.2 蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状n7.2.1 7.2.1 根据化学组成测定最低相对分根据化学组成测定最低相对分子质量子质量 铁的原子量n铁的百分含量=100 最低相对分子质量 铁的原子量n最低相对分子质量=100铁的百分含量 n 55.8n例如，肌红蛋白

5、相对分子质量=100 0.335 =16700 用其他物理化学法法测得的肌红蛋白Mr与此极为接近，可见肌红蛋白分子中只含一个铁原子。蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状7.2.2 7.2.2 渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量渗透与渗透压渗透与渗透压n渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量n溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）单方向净移动现象称为渗透渗透(osmosis)(osmosis)。渗透的结果，溶液内的体积增加，液面升高，直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压渗透压（osmotic pressure)osm

6、otic pressure)。n渗透压是单位体积内溶质质点数的函数，而与溶质的性质和形状无关。n在浓度不大时，渗透压与溶质的相对分在浓度不大时，渗透压与溶质的相对分子量的关系为：子量的关系为：n=RT(c/Mr +K c2)nMr=RT/lim/cn c0蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状n7.2.3 7.2.3 蛋白质的扩散和扩散系数蛋白质的扩散和扩散系数n扩散（diffusion）ndm/dt=-DA dc/dxnD 扩散系数n扩散系数随Mr的增加而降低。n但扩散系数对Mr的变化并不敏感。n7.2.4 7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n蛋白质溶液在

7、电场中受到蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力强大的离心力作用时，如果作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。n沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分子形状、溶液的密度和粘度有关。子形状、溶液的密度和粘度有关。n沉降速率法沉降速率法n沉降平衡法沉降平衡法沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n离心机n转速 60 000-80 000rpmn离心力 400 00-700 000沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量离心力离心力 42 v 2 r F=

8、-g F 为离心力，单位以地心引力的倍数为离心力，单位以地心引力的倍数g表示（即表示（即g 或或g）g 为重力加速度，等于为重力加速度，等于980.6 cm2/s2.r 通常指自离心管中轴底部内壁到离心转轴中心之间的距离通常指自离心管中轴底部内壁到离心转轴中心之间的距离（cm）v 为转速，即离心机每秒的转数，若以每分钟转数（为转速，即离心机每秒的转数，若以每分钟转数（rpm）表示，则上式应为表示，则上式应为 42 v 2 r F=-（1/60）2 g n7.2.4.1 沉降速率法沉降速率法n沉降界面沉降界面nn n单分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力单分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力

9、与摩擦力的关系：的关系：nn nFc-Fb=Ffnn n dx/dt mp(1-)n =n 2 fn n dx/dtn s=n 2n n单位离心场的沉积速度是个定值，称为单位离心场的沉积速度是个定值，称为沉降系沉降系数数（sedimentation coefficient)sedimentation coefficient)或或沉降常沉降常数数。n蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于1 11010-1313 到到20020010 10-1313 秒的范围。秒的范围。n10 10-1313 秒作为一个单位，斯维得贝格单位或沉降系数秒作为一个单位，斯维得

10、贝格单位或沉降系数单位，即单位，即S S。沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n7.2.4.2 7.2.4.2 沉降平衡法沉降平衡法n利用沉降平衡法测定相对分子质量是在较低速度（8000-20000r/min）的离心场中进行的。n蛋白质的沉降平衡蛋白质的沉降平衡（图7-3）沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n在时间dt内浓度为c的溶液越过横截面A的溶质量：dm=-cA dx/dt dtn因此扩散作用沿相反方向越过横截面A的溶质量：dm=-DA dc/dx dt沉降沉降分析分析法测法测定相定相对分对分子质子质量量n当净离心力与扩散力平衡时，在离心池内从液当净离心

11、力与扩散力平衡时，在离心池内从液面到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度，面到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度，因此：因此：n 2RTdln(c2/c1)nMr=n (1-)2(x22-x12)沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n7.2.5 凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量n凝胶过滤法的原理凝胶过滤法的原理层析柱的洗脱体积与分子量的关系：层析柱的洗脱体积与分子量的关系：Ve=K1-K2lgM凝凝胶胶过过滤滤法法测测定定相相对对分分子子质质量量n7.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定 相对分子质量相对分子质量SDSSDS，有效变性

12、剂，带负电荷有效变性剂，带负电荷巯基乙醇，巯基乙醇，打开二硫键打开二硫键蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。nRf=K1-K2 lg Mn7.3 7.3 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀n7.3.1 7.3.1 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质n蛋白质溶液是一个分散系统蛋白质溶液是一个分散系统n分散相质点 100nm的为悬浊液，n 介于1-100nm的为胶体溶液。蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀n胶体系统的稳定条件：胶体系统的稳定条件：n1 1 分散相质点的大小分散相质点的大小n2 2 分

13、散相质点带有同种电荷分散相质点带有同种电荷n3 3 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层分散相质点能与溶剂形成溶剂化层+n每克蛋白质分子能结合每克蛋白质分子能结合0.3-0.50.3-0.5克水。克水。n蛋白质溶液具有：丁达尔效应，布朗运动及蛋白质溶液具有：丁达尔效应，布朗运动及 不能通过半透膜的性质不能通过半透膜的性质。蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀n7.3.2 7.3.2 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀n沉淀蛋白质的方法 ：n1 1）盐析法）盐析法n 盐析一般不引起蛋白质的变性。n2 2）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法 脱去水化层及降低介电常数。n3 3）重金属盐沉淀法）

14、重金属盐沉淀法 生成不溶性的复合物n4 4）生物碱试剂和某些酸类沉淀法）生物碱试剂和某些酸类沉淀法 单宁酸，三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸。n5 5）加热变性沉淀法）加热变性沉淀法n7.4 7.4 蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的一般原则n蛋白质分离纯化的程序包括：蛋白质分离纯化的程序包括：n1）前处理n2）粗分级分离n3）细分级分离n4）结晶n7.5 7.5 蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法n根据蛋白质在溶液中的性质的分离纯化方法有：n1）分子大小n2）溶解度n3）电荷n4）吸附性质n5）对配体分子的生物学亲和力n7.5.1 7.5.1 根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同

15、的纯化方法n7.5.1.1 7.5.1.1 透析和超过滤透析和超过滤n常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢纸。n透析装置透析装置n利用压力和离心力的超过滤装置利用压力和离心力的超过滤装置蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法大分子大分子膜膜小分子小分子小分子小分子蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.1.2 7.5.1.2 密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心n蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也决定于它的密度。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法7.5.1.3 7.5.1.3 凝胶过滤凝胶过

16、滤1903-1906，M.Tswett 将叶将叶绿 素 的 石 油 醚 溶 液 通 过绿 素 的 石 油 醚 溶 液 通 过CaCO3管柱，并继续以石油管柱，并继续以石油醚淋洗，由于醚淋洗，由于CaCO3对叶绿对叶绿素中各种色素的吸附能力不素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带，柱中出现了不同颜色的谱带，所以称色谱图。所以称色谱图。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n凝胶过滤凝胶过滤n也称：n凝胶过滤层析n分子排阻层析n凝胶渗透层析凝胶过滤凝胶过滤n凝胶的交联度和孔度（网孔大小）决定了凝胶的分离分级范围。n常使用的凝胶有：n交联葡

17、聚糖（Sephadex）n聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P,PAGE)n琼脂糖(Sepharose Bio-gel A)凝凝胶胶过过滤滤n凝胶过滤的原理是：凝胶过滤的原理是：n当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构，不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；的空隙向下移动并最先流出柱外；n比网孔小的分子比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。的内外。n这样由于不同大小分子所

18、经过的路径不同而得这样由于不同大小分子所经过的路径不同而得到分离。到分离。柱层析的基本装置柱层析的基本装置 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法 层析柱通常是玻璃的。层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨总的说来，长柱分辨率高。但大量物质的率高。但大量物质的处理则用粗的柱比较处理则用粗的柱比较适宜。层析柱的基本适宜。层析柱的基本装置如图。装置如图。层析柱层析柱蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法凝胶过滤的术语nVt 凝胶柱床的总体积nVe 洗脱体积nV0 孔隙体积，外水体积nVi 内水体积nVm 凝胶基质体积 nVt=Vi+V0+Vm蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.2

19、 7.5.2 利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法n7.5.2.1 7.5.2.1 等电点沉淀和等电点沉淀和pHpH控制控制n7.5.2.2 7.5.2.2 蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析n盐溶n盐析蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n盐析作用盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。n此时那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。n随着盐浓度的增加，蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。n因此最

20、先聚集的蛋白质是表面上疏水残基最多的蛋白质。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.2.3 7.5.2.3 有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法n与水互溶的有机溶剂（如甲醇，乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。室温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。n控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。n有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。n介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的引力。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.2.4 7.5.2.4 温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响n在一定温度范围内，约 0-40 之间，大部

21、分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加。n人的血红蛋白从0-25，溶解度随温度上升而上升。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.3 7.5.3 根据电荷不同的纯化方法根据电荷不同的纯化方法n7.5.3.1 电泳电泳n在外电场作用下，带电颗粒，如不处于等电点在外电场作用下，带电颗粒，如不处于等电点的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。动，这种现象称为电泳。n区带电泳(zone electrophoresis)可分四类：na 滤纸电泳和薄膜电泳；nb 粉末电泳；nc 细丝电泳；nd 凝胶电泳，适于分离蛋白质和多核苷酸、核酸。蛋

22、蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法v电泳装置主要包括两个部分：电源电泳装置主要包括两个部分：电源(电泳仪）和电电泳仪）和电泳槽。泳槽。v电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。分子的迁移。电泳装置电泳装置蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.3.2 7.5.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n有时用不连续的胶（浓缩胶与分离胶）有时用不连续的胶（浓缩胶与分离胶）n不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳有不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳有3 3种物理作用：种物理作用：n1.1.样品的浓缩效应

23、样品的浓缩效应n2.2.分子筛效应分子筛效应n3.3.电荷效应电荷效应蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法SDS-PAGE原理原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Acrylamid 丙烯酰胺丙烯酰胺N,Nmethylenebisacrylamide N，N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺v聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3 33030之间。之间。v低浓度的凝胶具有较大的孔径，如低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3-43-4的聚丙烯酰胺的聚丙烯

24、酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于等电聚焦凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于等电聚焦或作为或作为PAGEPAGE电泳的浓缩胶，也可以用于分离电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNADNA。v高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如如10102020的凝胶常用于的凝胶常用于PAGEPAGE电泳的分离胶。电泳的分离胶。SDS-PAGE原理原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.3.3 7.5

25、.3.3 毛细管电泳毛细管电泳n电泳是在微内径管（一般为50um内径和300um外径）内进行的.n一般管长50100 cm，电压1050 kV，时间1030 min。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法毛细管电泳毛细管电泳n虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而电电渗作用渗作用(electroendosmosis(electroendosmosis)使他们向负使他们向负极移动。由于电渗流很强，其速度一般比样品极移动。由于电渗流很强，其速度一般比样品的电泳速度大，因此所有的正、负离子和中性的电泳速度大，因此所有的正、负离子和中性分子都被推向负极分子都被推向负

26、极。/蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法毛细管电泳毛细管电泳n7.5.3.4 等电聚焦等电聚焦n等电聚焦（等电聚焦（isoelectricisoelectric focusing,IEF focusing,IEF）或）或称电聚焦称电聚焦(electric focusing,EF)(electric focusing,EF)n两性电解质两性电解质npHpH梯度梯度蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法等电聚焦电泳原理等电聚焦电泳原理 在在IEFIEF的电泳中，具有的电泳中，具有pHpH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，梯度的介质其分布是从阳极到阴极，

27、pHpH值逐渐增大。值逐渐增大。蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷，向阳极移动，直至某一蛋白质分子带负电荷，向阳极移动，直至某一pHpH位点时失去电荷位点时失去电荷而停止移动，此处介质的而停止移动，此处介质的pHpH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点。恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。到它们的等电点上聚焦为止。在电场内经过一定时间后，等电点不同的蛋白质混合物的各在电场内经过一定时间后，

28、等电点不同的蛋白质混合物的各组分将分别聚焦在各自等电点相应的组分将分别聚焦在各自等电点相应的pHpH位置上，形成分离的蛋白位置上，形成分离的蛋白质区带。质区带。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法等电聚焦电泳原理等电聚焦电泳原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法等电聚焦电泳等电聚焦电泳蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法等电聚焦电泳应用等电聚焦电泳应用1 1分离等电点不同的蛋白质。分离等电点不同的蛋白质。2 2测定某个未知蛋白质的等电点。测定某个未知蛋白质的等电点。3 3研究蛋白质微观不均一性。研究蛋白质微观不均一性。4.4.蛋白质纯化制备。蛋白质纯化制备。5 5用于用于IEF/

29、SDS-PAGEIEF/SDS-PAGE双向电泳。双向电泳。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法双向电泳（双向电泳（2-DE）与蛋白质组学）与蛋白质组学同基因组学一样同基因组学一样,蛋白质组学蛋白质组学不是一个封闭的、概不是一个封闭的、概念化的、稳定的知识体系念化的、稳定的知识体系,而是一个领域。而是一个领域。它旨在阐明生物体全部蛋白质的它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式表达模式及及功能功能模式模式，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等，是连接基因组细胞内定位、相互作用研究等，是连接基因组序列与基因功能之间的桥梁。序列与

30、基因功能之间的桥梁。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法双向电泳（双向电泳（2-DE）低氧蛋白质组的低氧蛋白质组的2-D电泳图电泳图 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.3.6 7.5.3.6 离子交换层析离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC）蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法离子交换层析离子交换层析 离子交换层析是以离子交换层析是以离子交换剂离子交换剂为为固定相固定相，依据流动相中的依据流动相中的不同带电组分不同带电组分与交换剂上的平与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的能力的差别（与离子衡离子进行可逆交换时的能力的差别（与离子交

31、换剂结合力的差别）而进行分离的一种层析交换剂结合力的差别）而进行分离的一种层析方法。方法。离子交换层析是生物化学领域中常用的离子交换层析是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。等的分离纯化。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n纤维素离子交换剂纤维素离子交换剂n交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂n盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电荷吸附容量。荷吸附容量。因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液因此，蛋白质混合物的分

32、离可以由改变溶液中的盐离子强度和中的盐离子强度和pHpH来完成。来完成。梯度混合器梯度混合器蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法离子交换层析离子交换层析离子交换层析的原理离子交换层析的原理n离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。的结合力不同而进行分离纯化的。n离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。上某种电荷基团形成的。

33、+-高分子聚合物基质高分子聚合物基质电荷基团电荷基团平衡离子平衡离子蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法离子交换层析的原理离子交换层析的原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法离子交换层析系统的组成离子交换层析系统的组成蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法离子交换层析的操作流程离子交换层析的操作流程1 1。离子交换剂的选择和预处理离子交换剂的选择和预处理2 2。装柱。装柱3 3。平衡平衡4 4。加样和淋洗。加样和淋洗5 5。洗脱。洗脱6 6。收集、鉴定及保存收集、鉴定及保存7 7。基质的再生。基质的再生 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.4 7.5.4 利用选择性吸

34、附的纯化方法利用选择性吸附的纯化方法n吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附剂之间的吸附能力吸附能力和和解吸性质解吸性质不同而达不同而达到分离目的。到分离目的。n材料：硅胶材料：硅胶（硅烷醇（硅烷醇Si-OH）n 氧化铝氧化铝n 活性炭活性炭蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.4.1 7.5.4.1 羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析n结晶磷酸钙结晶磷酸钙n分离蛋白质、核酸分离蛋白质、核酸蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.4.2 7.5.4.2 疏水作用层析疏水作用层析n蛋白质存在于分子表面的疏水氨基酸残基的数蛋白质

35、存在于分子表面的疏水氨基酸残基的数量是不同的。量是不同的。n连接在支持介质（如琼脂糖）上的连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团疏水基团与与蛋白质表面上暴露的蛋白质表面上暴露的疏水基团疏水基团结合。结合。n使用逐渐降低离子强度或增加使用逐渐降低离子强度或增加pHpH的洗脱液的洗脱液。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.5 7.5.5 利用对配体的特异生物学亲和力利用对配体的特异生物学亲和力 的纯化方法的纯化方法亲和层析亲和层析(affinity chromatography)蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法(2)SpecificBindingSubstance(B)溶 離

36、Elution(4)配 體Ligand(A)耦合反應 (3)Coupling Reaction雜 質BBBB(1)Solid MatrixB亲和层析的原理亲和层析的原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法固相擔體固相擔體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團配體XBAA亲和层析的原理亲和层析的原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法ActivityProtein改变洗脱条件改变洗脱条件*Elution volume亲和层析的原理亲和层析的原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法加样淋洗加样淋洗亲和层析的亲和层析的 应用应用1.1.抗原和抗体抗原和

37、抗体2.2.激素和受体蛋白激素和受体蛋白 3.3.凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白 4.4.金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法7.5.6 7.5.6 高效液相层析和快速蛋白液相层析高效液相层析和快速蛋白液相层析n是离子交换、分子排阻、吸附和分配等层析技是离子交换、分子排阻、吸附和分配等层析技术的发展。术的发展。n对柱层析来说，载体的对柱层析来说，载体的颗粒愈小颗粒愈小、则、则分辨率愈分辨率愈高高，但是洗脱液的，但是洗脱液的流速也愈慢流速也愈慢。为解决这一矛。为解决这一矛盾，采用盾，采用高压高压和和颗粒度小颗粒度小而均匀、机械性能强、而均匀、机械性能强、化学性能

38、稳定的固定项以及其他相应的设备。化学性能稳定的固定项以及其他相应的设备。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法蛋蛋白白质质的的含含量量测测定定与与纯纯度度鉴鉴定定实用中经常是多种方法联合使用实用中经常是多种方法联合使用n7.6 7.6 蛋白质的含量测定与纯度鉴定蛋白质的含量测定与纯度鉴定n7.6.1 7.6.1 蛋白质含量测定蛋白质含量测定n凯氏定氮法凯氏定氮法、n双缩脲法、双缩脲法、nFolinFolin酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）法）、n紫外吸收法、紫外吸收法、n染料结合法染料结合法(Bradford(Bradford法法)n胶体金测定法。胶体金测定法。n7.6.2 7.

39、6.2 蛋白质纯度测定蛋白质纯度测定n电泳电泳n 等电聚焦等电聚焦 PAGE SDS-PAGE PAGE SDS-PAGE 毛细管电泳毛细管电泳n 纯的蛋白呈一条带或峰纯的蛋白呈一条带或峰n沉降沉降n 纯的蛋白以单一沉降速度运动纯的蛋白以单一沉降速度运动nHPLCHPLCn 纯的蛋白为单一的对称峰纯的蛋白为单一的对称峰n溶解度分析溶解度分析n 纯的蛋白质溶解曲线只呈现一个折点纯的蛋白质溶解曲线只呈现一个折点蛋蛋白白质质的的含含量量测测定定与与纯纯度度鉴鉴定定 7.7.蛋白质的分离、纯化和表征作业蛋白质的分离、纯化和表征作业n名词解释名词解释n等离子点，沉降系数，盐析，盐溶，等离子点，沉降系数，盐析，盐溶，n密度梯度离心，透析，超过滤，凝胶过滤，密度梯度离心，透析，超过滤，凝胶过滤，SDA-PAGESDA-PAGE电泳，等电聚焦，亲和层析电泳，等电聚焦，亲和层析n回答问题：回答问题：n1.1.试述根据分子大小不同、溶解度不同、电荷试述根据分子大小不同、溶解度不同、电荷 n 不同分离蛋白质的方法都有哪些不同分离蛋白质的方法都有哪些n2.2.蛋白质含量测定的方法都有哪些？蛋白质含量测定的方法都有哪些？n3.3.书书 p317 p317 第第 1 1，5 5，7 7，8 8题题THE END