第6章-酶的非水相催化课件.ppt

1、Chapter 6 Enzymatic catalysis in Non-aqueous system酶的非水相催化酶的非水相催化非水相酶学的诞生非水相酶学的诞生水是酶促反应最常用的反应介质。水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物许多有机化合物(底物底物)在水介质中难溶或不溶。在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？是否存在非水介质能保

2、证酶催化？1984年，克利巴诺夫（年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应体系中进行催化反应。非水相酶催化的优点o脂溶性底物和产物在有机溶剂中的溶解性较高，有利于提高底物和产物浓度的水平；o 在适当的条件下，可以使酶促反应的热力学平衡向合成方向(而不是水解方向)移动；同时由于有

3、机溶剂的存在，含水量减少，大大降低了许多水参与的副反应；o在非水相中酶的稳定性得到显著提高。如猪胰脂肪酶在99%的有机溶剂中100 C保温数十个小时仍保持较高的酶活性。而在此温度条件下，酶在水溶液中却迅速失活；o由于酶不溶于有机溶剂中，酶的重复利用更加方便；o可以省略产物的萃取分离过程，提高了产物得率；o在有机溶剂存在的条件下，一般不存在微生物对反应体系的污染问题。非水相酶催化的缺点-酶催化活力下降 但与酶在水相中催化时的活性相比，酶在有机溶剂中催化时的活性大大降低。如下因素常被认为与酶在非水相中催化活性降低有关o在制备酶干粉进行冷冻干燥时酶活性中心构象会发生变化或与有机溶剂直接接触导致的酶活

4、性构象改变；o 酶在有机溶剂中的构象过于刚硬(rigid)导致活性降低；o由于酶在有机溶剂中不能溶解，可能存在底物和产物的扩散限制；o底物在不同溶剂中去溶剂化能(desolvation energy)的差异；opH变化，尤其对于交联体晶体酶而言。同时在冷冻干燥过程中使用挥发性缓冲液也可能导致酶最适pH的改变。Contents of chapter 61、酶催化反应的介质2、非水相反应体系 3、影响酶在非水反应介质中催化的因素 4、非水相酶催化反应中酶催化的调控 GoGoGoGo5、酶非水相催化的应用 Go第一节第一节 酶非水相催化的反应介质酶非水相催化的反应介质 有机介质有机介质气相介质气相介

5、质超临界介质超临界介质离子液体离子液体氟溶剂氟溶剂一一 酶非水相催化的反应介质酶非水相催化的反应介质有机溶剂有机溶剂o是目前研究最多的一种非水反应介质o应用较多的一种反应介质二二 酶非水相催化的反应介质酶非水相催化的反应介质-气相气相优点：o避免了有机溶剂的使用；o酶的回收较为方便；o气相中底物和产物的传质效果较好。缺点:o反应器中的反应物浓度受到底物蒸汽压的影响 o酸与醇的酯化反应中酶还受到酸蒸汽的不可逆抑制失活作用 三三 酶非水相催化的反应介质酶非水相催化的反应介质超临界流体超临界流体优点:o超临界流体有极好的扩散性和很低的黏度，有利于底物向酶分子扩散。底物在超临界中的溶解度还可通过调节超

6、临界流体的压力和温度来改变。o由于通常用于酶催化反应的超临界流体为二氧化碳，它在常温下是气态不会与产物混合，所以可制得高纯度的产物。缺点:o设备复杂，难于连续生产和进行工业放大。o反应介质还会降低酶表面的pH 值且还可能对酶表面进行化学修饰o反应结束后取出产物的减压过程也容易造成酶的失活。四四 酶非水相催化的反应介质酶非水相催化的反应介质-氟溶剂氟溶剂 o高氟代烃通常具有极大的惰性、非极性、热力学稳定、无毒，和一般的有机溶剂、水不能混溶。o具有高氟化基团的化合物会优先溶解于含氟溶剂中*如Goto 等人发现一些脂肪酶在全氟辛烷(perfluorooctane)中催化反应的速率超出酶在异辛烷中催化

7、反应的速率10倍之多。五五 酶非水相催化的反应介质酶非水相催化的反应介质离子液体离子液体(一)离子液体的结构及分类 离子液体是呈现为液态的盐 离子液体是完全由阴阳离子组成且常温下呈液态的离子化合物，这些离子化合物结构上存在离子结构对称性低、分子间作用力弱等特点，导致了离子液体熔点接近室温或低于室温，使离子液体成为一种以液态方式存在的盐。o从理论上来讲，这种室温呈溶解状态的盐(molten salt)按阴阳离子不同排列组合方式有1018 种之多，数量十分庞大，但根据阳离子母体的不同可将常见的离子液体大致归纳为四类：分别是咪唑盐类(A)；吡啶盐类(B)；季铵盐类；(C)和季鏻盐类；(D)其阳离子的

8、结构:o可作为离子液体的阴离子有：BF4-、PF6-、TA-(CF3COO-)、HB-(C3F7COO-)、TfO-(CF3SO3-)、NfO-(C4F9SO3-)、Tf2N-(CF3SO2)2N-)、Beti-(C2F5SO2-)2N-)、Tf3C-(CF3SO2-)3C-)、SbF6-、AsF6-、NO2-等。(二)离子液体的优点 o离子液体具有热稳定性高、蒸汽压低和对环境友好等特点而被研究者称为“绿色”的溶剂 A 室温离子液体没有显著的蒸汽压。虽然在室温离子液体中，阴阳离子间的库仑力较弱，但和一般分子溶剂的分子间的作用力相比，离子液体显然要大得多，因此即使在较高的温度下，离子液体也不易挥

9、发，故离子液体可用于高真空体系，而且对环境无污染，有望为绿色工业开辟新的道路。B 离子液体有较好的热稳定性、化学稳定性，可以不必考虑其它溶剂通常具有的易燃性，大大提高了实验室和工业应用中的安全性和可操作性。o离子液体强极性的特点也拓宽了酶催化反应介质选择的范围，这是因为强极性底物一般用强极性溶剂来溶解，但强极性有机溶剂常常使酶失活，而在相同强极性的离子液体中，酶却表现出较好的活性和稳定性 *离子液体强极性的特点使它对精细化工和医用产品起始材料的“构建单元”(如肽、糖、核酸等极性底物)具有的较强的溶解性，预示着离子液体可能在精细化工和医用产品生产上扮演重要角色。o同时还有很多研究者认为离子液体是

10、一种“可设计”的溶剂，可以通过合成手段合成一系列结构和性质迥异的离子液体来满足各方面研究和应用的需求。(三)离子液体缺点离子液体也有一些缺点妨碍着它的应用。n已合成的离子液体大多黏度很高，这势必给底物和产物的传质带来困难。Kragl等人发现尽管-糖苷酶在80C高温下在离子液体1-甲基-3-甲基咪唑甲基璜酸盐(1-methyl-3-methylimidazolium methanesulfonate,MMIMCH3SO3)中仍具有很高的稳定性，但80C的高温仍然没有解决离子液体粘度较大带来的传质困难。n尽管有些离子液体成本可达到70欧元/kg，但价格仍然是限制其应用的重要因素。因此离子液体能否能

11、完全回收利用是其能否工业化应用的重要条件。一一 无溶剂反应体系无溶剂反应体系优点：o无溶剂反应具有很高的底物浓度，在不存在底物抑制的情况下，有利于提高反应速度并推动反应向产物方向进行，从而得到高浓度的产物。o因为在反应中没有使用有机溶剂，也就避免了有机溶剂对酶活性的影响。同时有机溶剂用量减少也在一定程度上提高了产品的安全性，这对于食品和医药工业是非常重要的，这也符合环境保护的要求。o不使用溶剂就相应减小了反应器的体积，这对工业生产来说就是大大降低了生产成本，有利于工艺的工业化。o 反应结束后无需考虑从反应体系中分离出反应溶剂，简化了产物分离纯化工艺。缺点:o但酶在无溶剂条件下进行催化也存在着许

12、多困难和问题：高浓度的底物和反应中形成的产物可能对酶起抑制作用，这会对酶的催化活性产生不利影响；o另外反应底物本身的黏度可能很大，可能会使底物与酶难以充分混合，从而导致反应速率过慢。第二节第二节 反应体系反应体系二二 拟低共熔反应体系拟低共熔反应体系o所谓低共熔混合物，是指两种或两种以上的组分，在一定组分比率下会表现出比纯组分熔点低的低共熔点，并且多相共存。底物固、液相同时存在是低共熔混合物能被酶催化的原因。o拟低共熔反应体系中进行酶催化反应，具有产物浓度高、对环境友好等许多优点，但也有研究者认为在该体系中调节酶的催化特性比较困难。三三 两相体系两相体系o有机溶剂水两相体系 在有机溶剂水两相体

13、系中，多数酶分子处在水相中不与有机溶剂直接接触从而能保持较高活性；而大部分底物则溶解在有机相中，在水相中底物或产物的浓度较低这样可以避免底物或产物对酶产生的抑制作用。同时产物从酶分子表面脱落进入有机相中有利于反应向生成产物方向进行。o存在着相界面，这样会给反应带来传质和传热阻力。同时相界面的存在还导致了酶的界面失活。而且在有些情况下溶解于水相的少量有机溶剂还能对酶的活性产生影响。*还有离子液体超临界反应体系，离子液体水反应体系等体系 构建双水相体系实现在线产物分离Top phaseBottom phase Substrates Product Product Side product Bioc

14、atalyst四四 反相胶束体系反相胶束体系 o在水有机溶剂两相体系和微水有机溶剂体系中，仅有少数酶能够保持催化活性，而能在反相胶束体系中催化的酶的种类更多(酶在胶束中水池中活力更大)。从一定意义上说，反相胶束体系也是一种两相体系，但它用于传质的相面积更大。酶的重复利用和产物同步分离上仍存在许多问题 微团效应使某些酶活性增加o超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity）。o认为：超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这通过与酶相关基团作用改变酶构象而影响酶活。五五 氟溶剂的两相体系氟溶剂的两相体系 催化中均相反应有利于底物传质催化中均相反应有利于底物传质

15、,而两相体系有利而两相体系有利于分离于分离,氟溶剂这种可变为单相体系的两相体系同氟溶剂这种可变为单相体系的两相体系同时拥有两种优点时拥有两种优点第三节 影响酶在非水反应介质中催化的因素o水对非水相酶催化的影响 o冻干保护剂对酶构象的影响o反应介质对非水相酶催化的影响 o载体对非水相酶催化的影响 干燥的酶水合过程：o（1）与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）o（2）与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)o（3）凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.250.38g/g）o（4）酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。一 水对非水相酶催化的影响o水参与了所有维持酶活性构象的非

16、共价结合力(静电力、范德华力、疏水相互作用及氢键)，因此水在酶催化中扮演着极其重要的角色。oVisser和Reinhoudt等人等用时间分辨荧光光谱(Time-Resolved Fluorescence)研究了酶悬浮于有机溶剂中的结构构象，发现随着水化程度的提高，酶分子的柔性逐渐增加，酶活性也增加，这为水分子的润滑剂作用提供了更直接试验依据。这部分充当润滑剂的水分子称为”结构水”。o极性有机溶剂可以夺取酶水化层的大部分水，甚至结构水。而非极性溶剂夺取水的能力较弱，因此在极性有机溶剂中酶容易丧失活性，而在非极性溶剂中，酶可以保持较高的催化活性和稳定性。水的作用过多水的危害并不是在有机溶剂中水分越

17、多越对反应有利:o过多的水分会进一步水化蛋白中极性低的基团使蛋白构象更松散引起一些构象微调来降低酶活性；o还值得注意的是由于水和大部分酶的失活作用有关，尤其是酶的“热失活”。温度升高时酶分子发生可逆折叠，然后进行下述一种或几种反应：(1)形成不规则的结构；(2)通过消除反应使二硫键破坏；(3)天冬氨酸和谷氨酰氨残基的脱酰氨；(4)天冬氨酸残基的肽键水解。o另外也有人认为太多的水会使酶积聚成团，导致疏水底物较难进入酶的活性部位，引起传质阻力。水分对不同形式酶的影响也不同，对于一些固定化酶来说，过多水分子在载体上的吸附有可能导致底物的传质限制；o同时在有水生成的可逆反应(如酯化、酯交换)中，水分的

18、存在也对反应的热力学平衡不利。酶最适含水量o可以看出，在非水相酶反应体系中存在一个“最佳含水量”。该最佳含水量不仅取决于酶种类的不同，也与所选用的有机溶剂有关。通常最佳含水量极低，并未达到水在有机溶剂中的饱和点。o早期的研究试图用向反应体系中的加水量来表示“最佳水含量”，事实上这并不恰当。因为体系中的水会在溶剂、酶、载体、甚至底物之间进行分配。oHailing提出用水的热力学活度(water activity,aw)表示非水相体系中的水含量，水活度的大小直接反映出酶分子上水分的多少，与体系的其他因素无关。水活度的调控o水活度的调控，通常利用特定的水合盐对，通过以下两种操作方式获得恒定的水活度：

19、n将酶和含有底物的溶剂分别与盐的饱和溶液平衡至相同的水活度，然后混合进行反应，如右图所示；n向干燥的反应器中直接加入一种高水合盐缓释部分水到体系中，本身变位低水合盐或无水盐，如Na2HPO4、Na2HPO4.2H2O、Na2HPO4.7H2O、Na2HPO4.12H2O。o通常有两种情况可改变体系的水活度：n反应中产生或消耗水；n溶剂化作用或相行为。二 冻干保护剂对酶构象的影响 o冷冻干燥是制备非水相催化用酶的一个重要手段，但冷冻干燥过程可能引起酶分子脱去”结构水”导致了酶构象的一些改变而影响酶的活性。加入冻干保护剂以后蛋白的二级结构与天然态蛋白(缓冲液中)的二级结构更相似。o冻干保护剂有很多

20、氢键,可在脱水过程中起着”氢键替代”作用,可弥补”结构水脱去引起蛋白构象变化;也有人认为冻干保护剂在冻干过程中包围在蛋白周围成玻璃态,防止蛋白分子间不正常聚集。o冷冻干燥作为酶的脱水过程对酶的活性中心和二级结构都有一定损害作用，而冻干保护剂则可以一定程度上保护酶的活性中心和构象，同时一定的冻干保护剂还可以降低底物传质障碍，这也可能是冻干保护剂影响酶在非水相中催化活性的一个途径。三 反应介质对非水相酶催化的影响 一般认为有机溶剂可以从如下几个方面影响酶的催化:(1)溶解于酶周围水分子层内的有机溶剂分子可与酶活性中心直接结合，或通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象，导致酶受抑制或引起酶失活、催化选择

21、性的变化；(2)有机溶剂会夺去酶分子表面的必需水分(结构水)，导致酶活性下降；(3)由于酶一般不溶于有机溶剂而成聚集体，而造成底物传质困难；(4)有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底底物和产物的从宏观溶液到酶表面水膜分配物和产物的从宏观溶液到酶表面水膜分配，从而影响酶的催化反应。(5)控制底物的溶剂能或稳定反应的过渡态,改变反应能量。溶剂的性质与lgPo最初，研究者认为溶剂的以下性质与酶催化活性具有很大的相关性：Hildebrand(希尔德布兰德)溶解度参数；介电常数；偶极矩；分配系数的对数lgP。溶剂理化性质相关系数gP(%)2lgP0.900.1Hildebrand溶解度参数0

22、.721介电常数-0.6325根据非相关变量计算获得的g值高于实验g值的概率lgP，为化合物在标准正辛烷-水两相体系中的分配系数的对数，严格意义上讲，lgP代表溶剂的疏水性(Hydrophobicity)，而非极性(Polarity)，但两者之间有密切的相关性。四 载体对非水相酶催化的影响 o酶分散性 立体屏蔽是由于载体的空隙太小，或者由于固定化方式与位置不当，给酶的活性中心或调节中心造成了空间障碍，因而底物与效应物无法和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。o对酶构象的影响 酶构象改变主要是酶和载体的相互作用引起了酶的活性中心或调节中心的构象发生了改变，从而导致酶活性的下降。o底物分配效应 分配

23、效应是由于固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其它效应物在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种效应。o水的分配及酶上结合水的影响 载体的亲水性越强，争夺水的能力就越强不利于维持酶的微水环境，使酶的活性构象受到影响。而疏水性载体利于水结合到酶分子周围，使酶保持高活性构象。最终固定化还需要考虑的因素有载体上酶的负载量、载体的表面积、颗粒大小、内部孔径大小等。五 pH选择和离子强度的影响pH选择：o在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。酶在水相的pH值可在有机相中保持，(pH 记忆现象)同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不

24、相同。可通过控制冻干前缓冲液pH值来达到控制pH的目的.o与“pH记忆”相似，蛋白质还具有配体“记忆”能力。蛋白质溶于高浓度配体溶液时，会形成大量弱结合复合物，冻干后用无水溶剂洗去配体，获得的蛋白质中会有许多由配体结合时留下的“印迹”，由于蛋白质在分子在无水溶剂中具有刚性，这些印迹得以保持，由此得到的蛋白质为“印迹蛋白质分子”。o其在无水溶剂中表现出对原始配体的极大结合容量，这种选择性结合，可用于专一性催化、分离纯化、生物传感器。第四节第四节 非水相酶催化反应中酶催化的调控 o通过酶工程方法调控o 基因水平的改造o 酶分子的化学修饰 o 固定化酶o 冻干酶o通过底物工程方法调控o通过介质工程方

25、法调控 o溶剂o水活o通过其它手段调控 添加剂 微波 超声 第五节第五节 酶非水相催化的应用酶非水相催化的应用 酶 催化反应 应用 脂肪酶脂肪酶 肽合成 青霉素G前体肽合成 酯合成 醇与有机酸合成酯类 转酯 各种酯类生产 聚合 二酯的选择性聚合 酰基化 甘醇的酰基化蛋白酶 肽合成 合成多肽 酰基化 糖类酰基化羟基化酶 氧化 甾体转化过氧化物酶 聚合 酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化酶多酚氧化酶 氧化 芳香化合物的羟基化 胆固醇氧化酶 氧化 胆固醇测定醇脱氢酶 酯化 有机硅醇的酯化(1)手性药物两种对映体的药理作用手性药物两种对映体的药理作用 药物名称有效对映体的作用另一种对映体的作用普萘洛尔（P

26、ropranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Penicillamine）羟基苯哌嗪(Dropropizine)反应停（Thalidomide）酮基布洛芬（Ketoprofen）喘速宁（Trtoquinol）乙胺丁醇（Ethambutol）萘必洛尔（Kebivolol）S构型，治疗心脏病,-受体阻断剂S构型，消炎、解热、镇痛S构型，抗关节炎S构型，镇咳S构型，镇静剂S构型，消炎S构型，扩张支气管S,S构型，抗结核病右旋体，治疗高血压,-受体阻断剂R构型，钠通道阻滞剂R构型，疗效很弱R构型，突变剂R构型，有神经毒性R构型，致畸胎R构型，防治牙周病R构型，抑制血小板凝集R,R构型，致失

27、明左旋体，舒张血管1992年，美国FDA明确要求对于具有手性特性的化学药物，都必需说明其两个对映两个对映体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况。许多国家和地区也都制定了有关手性药物的政策和法规。这大大推动了手性药物拆分的研究和生产应用。目前提出注册申请和正在开发的手性药物中，单一对映体药物占绝大多数。消旋化合物的拆分消旋化合物的拆分乙酸异丙酯乙酸乙烯醇酯 PSL 消旋化合物 RRSS+RCOOCH3OAcRCOOCH3OHRCOOCH3OHRCOOCH3OAcRCOOCH3OH有机溶剂有机介质中用脂肪酶(PSL)催化酯化用于

28、-羟基-,-不饱和酯的拆分。可以避免副反应的发生。(2)脂肪酶脂肪酶-位置选择性酯化反应位置选择性酯化反应OCH2OHOHOHOHOH+RCH2COOH吡啶DMFOCH2OHOHOHOHRCH2COO葡萄糖苷-6-O-酰基衍生物是一种可生物降解的非离子表面活性剂，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下进行选择性酯化得到：(3)(3)糖酯的合成糖酯的合成(4)脂肪酶脂肪酶-内酯合成反应内酯合成反应-羟基酸或它的酯在脂肪酶催化下，发生分子内环化作用得到内酯化合物。内酯可继续反应形成开链寡聚物.内酯化产物形式主要取决于羟基酸的长度外，也取决于脂肪酶的类型、溶剂及温度等。(5)生物柴油生物柴油生物柴油

29、是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。生物油脂的来源：菜子油，豆油，椰子油，棕榈油、蓖麻油、棉籽油，葵花籽 油，废食用油等优点：优点：（1）具有良好的环境属性（2）具有较好的低温发动机启动性能。（3）具有较好的润滑性能。（4）具有较好的安全性能。（5）具有良好的燃料性能。（6）具有可再生性能。从生物质到生物柴油生物柴油生产装备美国生物柴油发

30、展趋势美国生物柴油发展趋势生物柴油的生产方法生物柴油的生产方法o目前生物柴油主要是用化学法生产，采用酸、碱催化油脂与甲醇之采用酸、碱催化油脂与甲醇之间的酯交换反应，而生成脂肪酸甲酯间的酯交换反应，而生成脂肪酸甲酯。反应时间短，成本低。但在反应过程中使用过量的甲醇，而使后处理过程变得较为繁杂。能耗高；色泽深，在高温下容易变质；酯化产物难于回收；生产过程有废碱液排放o新方法：生物酶法，在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与小分子生物酶法，在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与小分子醇类的酯交换反应，生成小分子的酯类混合物醇类的酯交换反应，生成小分子的酯类混合物。条件温和，醇用量小、无污染排放。缺点：对甲醇及乙醇的转化率低，一般仅为40%60%，酶的使用寿命短。副产物甘油和水难于回收，不但对产物形成抑制，而且甘油对固定化酶有毒性，使固定化酶使用寿命短。