瓜类细菌性果斑病菌抗铜差异性检测课件.ppt

1、 答答 辩辩 人：单亚楠人：单亚楠 指导老师：高洁指导老师：高洁 教授教授 赵廷昌赵廷昌 研究员研究员 瓜类细菌性果斑病菌抗铜差异性检测瓜类细菌性果斑病菌抗铜差异性检测研究内容研究内容 2.材料与方法材料与方法 1.1.前言前言 3.5.致致 谢谢结果与分析结果与分析 4.结论与讨论结论与讨论1 前前 言言 瓜类细菌性果斑病（瓜类细菌性果斑病（BFB）是发生在葫芦科植物上的一）是发生在葫芦科植物上的一种严重的世界性病害，该病害为种传病害。病原菌为西瓜嗜种严重的世界性病害，该病害为种传病害。病原菌为西瓜嗜酸菌酸菌(Acidovorax citrulli，简称，简称Ac)，是近年来传入国内的是近年

2、来传入国内的检疫性有害生检疫性有害生物，物，1985年首次被鉴定为类产碱假单胞菌西瓜年首次被鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种亚种，1992年被更名为西瓜细菌性果斑病菌年被更名为西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)。菌株间存在比较丰富的遗传多样性，。菌株间存在比较丰富的遗传多样性，可以分为两个亚群，亚群可以分为两个亚群，亚群主要分离自甜瓜、南瓜等，亚群主要分离自甜瓜、南瓜等，亚群主要分离自西瓜等主要分离自西瓜等。瓜类细菌性果斑病是国内外西瓜类细菌性果斑病是国内外西瓜瓜甜瓜甜瓜上危害最为严重的病害之一上危害最为严重的病害之一。目前除了严格检疫尚无有效防

3、。目前除了严格检疫尚无有效防治措施。治措施。1.1 1.1 危害症状危害症状图图1 1：瓜类细菌性果斑病发病症状：西瓜子叶：瓜类细菌性果斑病发病症状：西瓜子叶(A),(A),西瓜真叶西瓜真叶(B),(B),西瓜果实西瓜果实(C),(C),甜瓜真叶甜瓜真叶(D),(D),甜瓜果实甜瓜果实(E),(E),甜瓜果肉甜瓜果肉(F)(F)1.2 瓜类细菌性果斑病的发生情况瓜类细菌性果斑病的发生情况 该病害自该病害自1998年在我国首次报道，年在我国首次报道，15年的时间已经遍布了年的时间已经遍布了我国许多农业大省我国许多农业大省。该病最早于。该病最早于1969年由年由Crall和和sehenckt在美国

4、佛罗里达州发现，并对果斑病的症状进行了描述在美国佛罗里达州发现，并对果斑病的症状进行了描述。1985年年wall和和santos在关岛报道了西瓜细菌性果斑病的发在关岛报道了西瓜细菌性果斑病的发生，并首次将其病原菌鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种。生，并首次将其病原菌鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种。1992年年Willems等人根据西瓜果斑病病原菌的等人根据西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和和DNA-DNA分子杂交研究结果，将其更名为西瓜细菌性果斑分子杂交研究结果，将其更名为西瓜细菌性果斑病菌病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)。1.3 瓜类细菌性果斑病的防治瓜类

5、细菌性果斑病的防治关于该病关于该病害害的防治方法有的防治方法有加强检疫加强检疫、药剂防治、种子处理、从药剂防治、种子处理、从无病区引种、生物防治、采用抗病品种等。目前应用最广泛的无病区引种、生物防治、采用抗病品种等。目前应用最广泛的是药剂防治，有效的药剂是铜制剂和抗生素。是药剂防治，有效的药剂是铜制剂和抗生素。5%百菌清百菌清1公斤公斤/亩、亩、14%络氨铜水剂络氨铜水剂300倍液或倍液或50%甲霜铜可湿性粉剂甲霜铜可湿性粉剂600倍倍液液,77%氢氧化铜可湿性微粒粉剂氢氧化铜可湿性微粒粉剂400倍液倍液,用量用量6075升升/亩亩,连连续续34次。硫酸链霉素或次。硫酸链霉素或72%农用链霉素

6、可溶性粉剂农用链霉素可溶性粉剂4000倍倍液液;40万单位的青霉素甲盐万单位的青霉素甲盐5000倍液。药剂防治方面主要倍液。药剂防治方面主要是是铜铜制剂制剂。1.4 1.4 本论文本论文研究研究目的及意义目的及意义我国的西瓜、甜瓜种植面积和产量都位居世界前列我国的西瓜、甜瓜种植面积和产量都位居世界前列。瓜类细。瓜类细菌性果斑病给我国西甜瓜生产造成了严重危害。用于田间防菌性果斑病给我国西甜瓜生产造成了严重危害。用于田间防治果斑病的主要是含铜杀菌剂治果斑病的主要是含铜杀菌剂。随着铜制剂的不断应用病原。随着铜制剂的不断应用病原菌对铜制剂抗性不断增加，而目前国内对果斑病菌菌株之间菌对铜制剂抗性不断增加

7、，而目前国内对果斑病菌菌株之间抗铜性的差异还没有报道，因此本试验对抗铜性的差异还没有报道，因此本试验对113株菌株的抗铜性株菌株的抗铜性进行了研究，阐明菌株间的抗铜性差异，进行了研究，阐明菌株间的抗铜性差异，从而为田间合理使从而为田间合理使用含铜杀用含铜杀菌菌剂提供有力的证据剂提供有力的证据。菌株号采集地点寄主分离部位亚群分离时间No.of strainLocationHostOrgan isolatedgroupTime isolatedAacw1内蒙古临河市西瓜叶片2002-9-3Aacw2内蒙古临河市西瓜叶片2002-9-3Fc247United states西瓜叶片2002-9-3Fc

8、520United States西瓜叶片2002-9-3pslb1内蒙古临河市甜瓜叶片2000-7-14pslb2内蒙古临河市甜瓜叶片2000-7-14pslb3内蒙古临河市甜瓜叶片2000-7-14pslb4内蒙古临河市甜瓜叶片2000-7-14pslb8内蒙古临河市甜瓜叶片2000-7-14pslb9内蒙古临河市甜瓜叶片2000-7-14pslb10内蒙古临河市甜瓜叶片2000-7-14pslb15内蒙古临河市甜瓜叶片2000-7-18pslb19内蒙古临河市八一乡甜瓜叶片2000-7-18pslb22内蒙古临河市八一乡甜瓜果实2000-7-18pslb23内蒙古临河市八一乡甜瓜果实200

9、0-7-182 材料与方法材料与方法2.1 供试菌株供试菌株表1 113株供试瓜类细菌性果斑病菌菌株pslb24内蒙古临河市八一乡甜瓜果实2000-7-18pslb25内蒙古临河市八一乡甜瓜果实2000-7-18pslb28内蒙古临河市八一乡甜瓜果实2000-7-18pslb29内蒙古临河市八一乡甜瓜果实2000-7-18pslb30内蒙古临河市八一乡甜瓜果实2000-7-18pslb31内蒙古临河市八一乡甜瓜叶片2000-7-25pslb35内蒙古巴盟农业多种经营站甜瓜子叶2000-8-20pslb36内蒙古巴盟农业多种经营站甜瓜子叶2000-8-20pslb37新疆甜瓜果实2000-9-9

10、pslb38新疆甜瓜果实2000-9-9pslb39新疆呼图壁甜瓜果实2000-9-14pslb40新疆呼图壁甜瓜果实2000-9-14pslb41新疆呼图壁甜瓜果实2000-9-14pslb42新疆呼图壁甜瓜果实2000-9-14pslb44新疆甜瓜果实2000-9-14pslb45新疆甜瓜果实2000-9-14pslb46新疆甜瓜果实2000-9-14pslb47新疆甜瓜果实2000-9-14pslb48新疆甜瓜子叶2000-9-14pslb49新疆甜瓜叶片2000-9-14pslb52新疆甜瓜叶片2000-9-14pslb53新疆甜瓜叶片2000-9-14pslb54新疆甜瓜叶片2000

11、-9-14pslb60新疆甜瓜叶片2000-9-14pslb61新疆甜瓜叶片2000-9-14pslb62新疆甜瓜叶片2000-9-14pslb63新疆甜瓜叶片2000-9-14pslb64新疆甜瓜叶片2000-9-14pslb65新疆甜瓜叶片2000-9-14pslb68新疆阿尔泰甜瓜叶片2001-8-26pslb69新疆阿尔泰甜瓜叶片2001-8-26pslb70新疆阿尔泰甜瓜叶片2001-8-26pslb71新疆阿尔泰甜瓜叶片2001-8-26pslb73新疆阿尔泰甜瓜叶片2001-8-26pslb74新疆阿尔泰甜瓜叶片2001-8-26pslb75新疆阿尔泰甜瓜叶片2001-8-26p

12、slb76新疆阿尔泰甜瓜叶片2001-8-26pslb88内蒙古临河市甜瓜果实2004-8-13pslb89内蒙古临河市甜瓜果实2004-8-13pslb90内蒙古临河市甜瓜果实2004-8-13pslb91内蒙古临河市甜瓜果实2004-8-13pslb92内蒙古临河市甜瓜果实2004-8-13pslb93新疆五家渠甜瓜叶片2005-7-21pslb94新疆五家渠甜瓜茎2005-7-21pslb95新疆五家渠甜瓜茎2005-7-21pslb96海南甜瓜茎2005-7-21pslb97山东甜瓜果实2009-5-4pslb98河北乐亭甜瓜果实2009-5-14pslb99浙江宁波甜瓜果实2009-

13、5-25pslb101海南甜瓜果实2009-11-12pslb102新疆(222 团)甜瓜叶片2010-7-15pslb103新疆(222 团)甜瓜叶片2010-7-15pslbtw19海南文昌西瓜嫁接苗2009-12-10pslbtw20海南三亚西瓜叶片2010-4-6Aac5台湾西瓜叶片2002-9-3Aac13台湾西瓜叶片2002-9-3Aac14台湾西瓜叶片2002-9-3Fc491Japan西瓜叶片2002-9-3pslb86新疆甜瓜叶片2004-7-7pslbtw2北京西瓜果实2005-6-13pslbtw3北京西瓜果实2005-6-13pslbtw5北京西瓜果实2005-6-30

14、pslbtw6北京西瓜果实2005-6-30pslbtw7北京西瓜果实2005-6-30pslbtw8北京西瓜果实2005-6-30pslbtw9北京西瓜果实2005-6-30pslbtw10北京西瓜果实2005-6-30pslbtw11北京西瓜果实2005-6-30pslbtw14广东西瓜果实2008-10-24pslbtw15山东西瓜叶片2009-5-4pslbtw16黑龙江哈尔滨西瓜叶片2009-11-2pslbtw22北京大兴西瓜果实2010-6-26pslbtw23北京大兴西瓜果实2010-6-26pslbtw24北京大兴西瓜果实2010-6-26pslbtw25北京大兴西瓜果实20

15、10-6-26pslbtw26北京大兴西瓜果实2010-6-26pslbtw27新疆打瓜果实2010-8-1pslbtw28新疆打瓜果实2010-8-1pslbtw29新疆打瓜果实2010-8-1pslbtw30新疆打瓜果实2010-8-1pslbtw31新疆打瓜果实2010-8-1pslbtw32黑龙江哈尔滨西瓜叶片2010-8-11pslbtw33黑龙江哈尔滨西瓜叶片2010-8-11pslbtw34黑龙江哈尔滨西瓜果实2010-9-1pslbtw35黑龙江哈尔滨西瓜果实2010-9-1pslbtw36黑龙江哈尔滨西瓜果实2010-9-1pslbtw37黑龙江哈尔滨西瓜果实2010-9-1

16、pslbtw38黑龙江哈尔滨西瓜果实2010-9-1pslbtw39海南文昌西瓜子叶2010-11-6pslbtw40海南西瓜子叶2010-11-6pslbtw41北京大兴西瓜子叶2010-12-24pslbtw42北京大兴西瓜子叶2010-12-24pslbtw43北京大兴西瓜子叶2010-12-242.2 2.2 供试试剂和仪器供试试剂和仪器 电磁炉，微波炉，高压灭菌锅，超净工作台电磁炉，微波炉，高压灭菌锅，超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司，（北京东联哈尔仪器制造有限公司，DL-CJ-2ND医用型），恒温培养箱（医用型），恒温培养箱（DHP120，上海实验仪器，上海实验仪器厂有限公

17、司），蛋白胨、琼脂粉、厂有限公司），蛋白胨、琼脂粉、磷酸氢二钾磷酸氢二钾、七水合硫酸镁七水合硫酸镁购自北京化学试剂公司购自北京化学试剂公司，五水硫酸五水硫酸铜购自天津大学科威公司铜购自天津大学科威公司。2.3 2.3 试验方法试验方法2.3.1 不同浓度硫酸铜不同浓度硫酸铜KB培养基配制培养基配制 用移液枪吸取硫酸铜母液加入溶化的用移液枪吸取硫酸铜母液加入溶化的KB培养基中，使硫酸培养基中，使硫酸铜铜 的终浓度分别为：的终浓度分别为：50 g/ml、100 g/ml、150 g/ml、200 g/ml、250 g/ml、300 g/ml、350 g/ml、400 g/ml，450 g/ml，5

18、00 g/ml，550 g/ml，600 g/ml、650 g/ml、700 g/ml、750 g/ml，混匀后倒平板备用。，混匀后倒平板备用。2.3.2 接种接种 活化实验室保存的活化实验室保存的113株果斑病菌株，株果斑病菌株，28培养培养48h后，挑后，挑取单菌落划线接种于不同浓度的硫酸铜平板上，每个浓度设置取单菌落划线接种于不同浓度的硫酸铜平板上，每个浓度设置3个重复，并划线接种于不含硫酸铜的个重复，并划线接种于不含硫酸铜的KB平板作为对照，平板作为对照，28培养，培养，1d后开始观察，观察后开始观察，观察10d。3 结果与分析3.1 3.1 供试菌株对硫酸铜抗性差异比较供试菌株对硫酸

19、铜抗性差异比较 所有菌株对小于所有菌株对小于300g/ml浓度均不敏感浓度均不敏感，300g/ml浓浓度时只有度时只有pslbtw43菌株表现敏感，在浓度达菌株表现敏感，在浓度达700g/ml时所有菌株在划线培养时所有菌株在划线培养10d后均不能生后均不能生长长，据此推断据此推断果斑病菌株对硫酸铜的最大抗性果斑病菌株对硫酸铜的最大抗性浓度浓度约为约为700g/ml。本试验结果与本试验结果与R.R.Walcott研究不一致研究不一致。表表2果斑病菌对不同浓度硫酸铜敏感度果斑病菌对不同浓度硫酸铜敏感度Table2 bacteria sensitivity to different concentr

20、ations of copper sulfate菌株号菌株号硫酸铜浓度（硫酸铜浓度（g/ml）50100150200250300350400450500550600650Aacw1Aacw2Aac5Aac13Aac14Fc247Fc356Fc376Fc491Fc520pslb1pslb2pslb3pslb4pslb8pslb9pslb10pslb15pslb18pslb19pslb22pslb23pslb24pslb25pslb27pslb28pslb29pslb30pslb31pslb35pslb36pslb37pslb38pslb39pslb40pslb41pslb42pslb44pslb

21、45pslb46pslb47pslb48pslb49pslb52pslb53pslb54pslb60pslb61pslb62pslb63pslb64pslb65pslb68pslb69pslb70pslb71pslb73pslb74pslb75pslb76pslb86pslb88pslb89pslb90pslb91pslb92pslb93pslb94pslb95pslb96pslb97pslb98pslb99pslb101pslb102pslb103pslbtw1pslbtw2pslbtw3pslbtw5pslbtw6pslbtw7pslbtw8pslbtw9pslbtw10pslbtw11p

22、slbtw14pslbtw15pslbtw16pslbtw19pslbtw20pslbtw22pslbtw23pslbtw24pslbtw25pslbtw26pslbtw27pslbtw28pslbtw29pslbtw30pslbtw31pslbtw32pslbtw33 注：注：“”表示生长，表示生长，“”表示不生长。表示不生长。pslbtw34pslbtw35pslbtw36pslbtw37pslbtw38pslbtw39pslbtw40pslbtw41pslbtw42pslbtw433.2亚群和亚群菌株抗铜性差异 在硫酸铜浓度为在硫酸铜浓度为500g/ml时时亚群亚群73%的菌株不能够生长

23、，而的菌株不能够生长，而亚群菌株亚群菌株在浓度为在浓度为650g/ml时仍有时仍有72%的菌株生长的菌株生长.即即亚群菌株抗铜性明显强于亚群菌株抗铜性明显强于亚群菌株，且在试验过程中，亚群菌株，且在试验过程中，亚群菌株的生长速率明显高于亚群菌株的生长速率明显高于亚群菌株。亚群菌株。硫酸铜浓度（硫酸铜浓度（g/ml）图图2 亚群和亚群和亚群菌株抗铜差异比较亚群菌株抗铜差异比较Fig2 subgroup and copper resistance difference3.3 3.3 不同寄主菌株抗铜性差异不同寄主菌株抗铜性差异 图图3 不同寄主菌株的抗铜差异分析不同寄主菌株的抗铜差异分析Fig3

24、Different strains of host resistance to copper variance analysis4 结论与讨论4.1 4.1 结论结论 本试验通过对比果斑病菌株本试验通过对比果斑病菌株亚群菌株和亚群菌株和亚群菌株、不同寄主菌亚群菌株、不同寄主菌株抗铜性差异，结果表明株抗铜性差异，结果表明:(1)亚群菌株抗铜性明显强于亚群菌株抗铜性明显强于亚群菌株，且在实验过程中，亚群菌株，且在实验过程中，亚群亚群菌株的生长速率明显高于菌株的生长速率明显高于亚群菌株。亚群菌株。(2)寄主为甜瓜的菌株比其他寄主的菌株有更高的铜抗性。而寄主为甜瓜的菌株比其他寄主的菌株有更高的铜抗性。

25、而亚群菌亚群菌株主要分离自甜瓜、南瓜等，株主要分离自甜瓜、南瓜等，亚群菌株主要分离自西瓜，两组分析亚群菌株主要分离自西瓜，两组分析得出的结论相符。得出的结论相符。本试验为大田中科学合理的防治果斑病提供了理论依据，在喷药过本试验为大田中科学合理的防治果斑病提供了理论依据，在喷药过程中，西瓜大田中配制农药浓度低于甜瓜大田，从而可以有效的减缓程中，西瓜大田中配制农药浓度低于甜瓜大田，从而可以有效的减缓菌株对农药的抗性提升。菌株对农药的抗性提升。4.2 4.2 讨论讨论 本试验得出的瓜类果斑病菌对硫酸铜的敏感浓度明显高于 R.R.Walcott的研究结果。两试验方法相同且两试验方法相同且两研究中来自共

26、同地方的菌株硫酸铜敏感度均与各两研究中来自共同地方的菌株硫酸铜敏感度均与各实验相一致，这就排除了两试验结果不同的地理因素实验相一致，这就排除了两试验结果不同的地理因素。结果不一致的可能原因是结果不一致的可能原因是R.R.Walcott所选的菌株均分离自所选的菌株均分离自2000年前，年前，而本试验所选的菌株均分离自而本试验所选的菌株均分离自2000年后，由于农药的使用、空气污染等年后，由于农药的使用、空气污染等使菌株的抗性增加。使菌株的抗性增加。本试验所选的本试验所选的113株菌株，来自我国西甜瓜产区的株菌株，来自我国西甜瓜产区的10个省市，试验结果个省市，试验结果可以体现我国果斑病菌株整体的

27、抗铜特征，具有代表性。可以体现我国果斑病菌株整体的抗铜特征，具有代表性。致致 谢谢 本论文是在导师高洁的悉心指导下完成的。从论文的选题、实验方案的设计到本论文是在导师高洁的悉心指导下完成的。从论文的选题、实验方案的设计到论文的撰写修改，每个环节都凝聚着赵老师的心血。高老师忘我的工作精神、严谨论文的撰写修改，每个环节都凝聚着赵老师的心血。高老师忘我的工作精神、严谨的治学态度、高尚的人格和平易近人的作风令我终生受益，激励我在今后的工作岗的治学态度、高尚的人格和平易近人的作风令我终生受益，激励我在今后的工作岗位和人生道路上不断前进与发展。高老师为我的学习付出了大量的心血。衷心感谢位和人生道路上不断前

28、进与发展。高老师为我的学习付出了大量的心血。衷心感谢高老师在学习和生活上对我的关怀和帮助，在此献上我最崇高的敬意和最诚挚的谢高老师在学习和生活上对我的关怀和帮助，在此献上我最崇高的敬意和最诚挚的谢意！意！论文完成期间，感谢王雪老师，感谢在实习期间赵廷昌老师、师姐王铁霖、林论文完成期间，感谢王雪老师，感谢在实习期间赵廷昌老师、师姐王铁霖、林振亚、杨姗姗、师兄赵文龙、刘慧琴老师在日常的学习生活中给予我点点滴滴的关振亚、杨姗姗、师兄赵文龙、刘慧琴老师在日常的学习生活中给予我点点滴滴的关心和帮助。还有在我周围一直支持我的同学，为我们搜寻就业信息，给我们提供建心和帮助。还有在我周围一直支持我的同学，为我

29、们搜寻就业信息，给我们提供建议。还有团委老师，班委们，他们为我们的学习生活一直忙碌着。议。还有团委老师，班委们，他们为我们的学习生活一直忙碌着。在我的学习生涯中，我成长的每一步都离不开父母的辛勤培养和无私关爱，他们在我的学习生涯中，我成长的每一步都离不开父母的辛勤培养和无私关爱，他们对我的鼓励和支持是我的坚实后盾，在此向他们献上最诚挚的敬意和感谢。对我的鼓励和支持是我的坚实后盾，在此向他们献上最诚挚的敬意和感谢。值此毕业之际，衷心感谢所有关心和帮助过我的老师、同学、亲人和朋友，祝福值此毕业之际，衷心感谢所有关心和帮助过我的老师、同学、亲人和朋友，祝福他们身体健康，工作顺利！他们身体健康，工作顺利！最后要感谢陪伴我四年的大学同学，不管我做什么决定都一直支持我，鼓励我，最后要感谢陪伴我四年的大学同学，不管我做什么决定都一直支持我，鼓励我，帮助我。帮助我。谢谢吉林农业大学，谢谢我周围所有的人，让我的大学生活丰富多彩。谢谢吉林农业大学，谢谢我周围所有的人，让我的大学生活丰富多彩。