微生物群落结构分析方法根据微生物利用碳源特性课件.ppt

1、v 膜磷脂脂肪酸图谱分析膜磷脂脂肪酸图谱分析(Phospholipid Fatty Acid Profile)v 代谢指纹技术代谢指纹技术(群落水平生理特征图谱群落水平生理特征图谱Biolog)Metabolic fingerprinting techniques-Community level physiological profiles(CLPPs)微生物群落结构分析微生物群落结构分析膜磷脂脂肪酸分析膜磷脂脂肪酸分析脂肪酸脂肪酸微生物微生物i15:0;a15:0;15:0;a16:0;i17:0;a17:0;17:0G+细菌细菌16:17c/+;cyc17:0;18:17c/+;cyc19

2、:0G-细菌细菌16:16c甲烷氧化细菌甲烷氧化细菌10Me17:0;10Me 18:0放线菌放线菌18:26,9;18:36,9,12真菌真菌微生物特异磷脂脂肪酸微生物特异磷脂脂肪酸脂肪酸分子通式：X:YZ（c/t）X：脂肪酸分子的总碳原子数；Y：烯键的数目；：双键的位置（从羧基端起计）;后缀c和t分别表示顺式和反式同分异构体a(anto):前异构甲基支链;cyc:环丙基支链;i(iso):异构甲基支链;Me:甲基支链在生物体中的浓度恒定：不随种类、生长条件和生理状态而变化应用细胞中特异化学成分的前提该物质仅存在于活的生物体中，在死亡微生物体或非生物的有机物质中量很小 磷脂脂肪酸仅存在于活细

3、胞的细胞膜中，死亡细胞膜磷脂被迅速分解 容易从细胞和土壤中提取出来；有测定该物质灵敏、准确的方法PLFAs可从土壤中直接提取出来，并用气相色谱测定其总量及种类特定微生物具有特异性PLFAs，膜磷脂脂肪酸分析反映微生物群体的多样性，可以用来测定微生物量中真菌和细菌比例在生物体中的浓度恒定：不随种类、生长条件和生理状态而变化微生物PLFAs 组成随环境及生理状态而有所变化膜磷脂脂肪酸总量与土壤微生物量(SIR法)的相关性(Bth&Anderson,2003)真菌膜磷脂脂肪酸特异性土壤中麦角甾醇(真菌组成指示物质)和18:26,9 PLFA含量之间的相关性(Bth&Anderson,2003)提取测

4、定土壤脂肪酸基本步骤提取测定土壤脂肪酸基本步骤土壤样本脂肪土壤样本脂肪提取提取 氯仿:甲醇:缓冲溶液=1:2:0.8(体积比)脂肪组分分离脂肪组分分离 通过硅酸柱将脂肪分为中性脂肪、糖脂和极性的磷脂3个组分根据脂肪酸的饱和度饱和度、羧基羧基数目数目及几何特性等，区分不同种类的磷脂脂肪酸气相色谱分析磷脂脂肪酸量生物多样性指标丰度 生态系统中物种总数；Species EvennessDiversity index Shannon 指标Simpson 指标Berger-Parker指标Alpha指标膜磷脂脂肪酸分析应用实例-土壤微生物中真菌细菌比例随土壤pH变化真菌细菌生物量系数真菌细菌生物量系数

5、用18:26,9 PLFA 和13种细菌特有的PLFA 分别作为真菌和细菌的指示物(Bth&Anderson,2003)定量描述微生物群落结构和生物多样性；敏感地反映微生物群落结构变化较为简单、有效微生物的PLFAs 组成随环境及生理状态而有所变化 大多数微生物细胞膜上占优势的脂肪酸组成很相 似，PLFAs分析不能鉴定微生物种类；是较为粗略的反映微生物群落结构和功能多样性的参数，不能指示群落中单个菌种的变化 PLFAsv 膜磷脂脂肪酸分析膜磷脂脂肪酸分析 （Phospholipid Fatty AcidsPLFAs）v 代谢指纹技术代谢指纹技术(Biolog)Metabolic fingerp

6、rinting techniques-Community level physiological profiles(CLPPs）微生物群落结构分析方法微生物群落结构分析方法根据微生物利用碳源特性，选择含有不同碳源物根据微生物利用碳源特性，选择含有不同碳源物质的微平板质的微平板 将土壤悬液接种于将土壤悬液接种于GN、GP、Ecoplate 微平板微平板中，微平板中氧化还原染料形成的颜色能指中，微平板中氧化还原染料形成的颜色能指示微生物对不同碳源的利用程度示微生物对不同碳源的利用程度 Ecoplate平板：平板：96孔微平板中含有孔微平板中含有3个重复的个重复的31种碳源种碳源BIOLOG 分析分

7、析代谢指纹技术代谢指纹技术-群落水平生理特征图群落水平生理特征图 微生物利用不同的碳源物质，产生电子传递体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)；四氮唑接受电子，转变为紫色的甲僭(音同建）；颜色的深浅及形成速度，反映不同类型微生物的数量及活性Biolog 测定原理A1WaterA2-Methyl-D-GlucosideA3D-Galactonic Acid -actoneA4L-ArginineA1WaterA2-Methyl-D-GlucosideB1Pyruvic Acid Methyl EsterB2D-XyloseB3D-Galac-turonic AcidB4L-AsparagineB1P

8、yruvic Acid Methyl EsterB2D-XyloseC1Tween 40C2I-ErythritolC32-Hydroxy Benzoic AcidC4L-Phenyl-alanineV1Tween 40C2I-ErythritolD1Tween 80D2D-MannitolD34-Hydroxy Benzoic AcidD4L-SerineD1Tween 80D2D-MannitolE1-Cyclo-dextrinE2N-Acetyl-D-GlucosamineE3-Hydroxy-butyric AcidE4L-ThreonineE1 -CyclodextrinE2N-Ac

9、etyl-D-GlucosamineF1GlycogenF2D-Glucosaminic AcidF3Itaconic AcidF4Glycyl-L-Glutamic AcidF1GlycogenF2D-Glucosaminic AcidG1D-CellobioseG2Glucose-1-PhosphateG3-Keto-butyric AcidG4Phenylethyl-amineG1D-CellobioseG2Glucose-1-PhosphateH1D-LactoseH2D,L-Glycerol PhosphateH3D-Malic AcidH4PutrescineH1D-Lactose

10、H2D,L-Glycerol PhosphateEcoPlateTM编号 No.碳源 Carbon substrates 类别 Classification A1 空白 control B1 丙酮酸甲酯 Pyruvic Acid Methyl Ester 羧酸类化合物 Carboxylic C1 聚山梨醇酯 40 Tween 40 多聚物 Polymers D1 聚山梨醇酯 80 Tween 80 E1-环式糊精?-Cyclodextrin F1 肝糖 Glycogen G1 D-纤维二糖 D-Cellobiose 碳水化合物 Carbohydrates H1-乳糖 -Lactose A2-甲

11、基-D-配糖物 -Methyl-D-Glucoside B2 D-木糖 D-Xylose C2 i-赤藻糖醇 i-Erythritol D2 D-甘露醇 D-Mannitol E2 N-乙酰基-D-葡（萄）糖胺 N-Acetyl-D-Glucosamine F2 D-葡（萄）糖胺酸 D-Glucosaminic Acid 羧酸类化合物 Carboxylic G2 葡萄糖-1-磷酸盐 Glucose-1-Phosphate 碳水化合物 Carbohydrates H2 D,L-?-甘油磷酸盐 D,L-?-Glycerol Phosphate A3 D-半乳糖酸-内酯 D-Galactonic A

12、cid-Lactone B3 D-半乳糖醛酸 D-Galacturonic Acid 羧酸类化合物 Carboxylic C3 4-羟基安息香酸 2-Hydroxy Benzoic Acid 芳香化化合物 Phenolic compounds D3 4-羟基安息香酸 4-Hydroxy Benzoic Acid E3-羟基丁酸 -Hydroxybutyric Acid 羧酸类化合物 Carboxylic F3 甲叉丁二酸 Itaconic Acid G3-丁酮酸 -Ketobutyric Acid H3 D-羟基丁二酸 D-Malic Acid A4 L-精氨酸 L-Arginine 氨基酸

13、Amino acids B4 L-天冬酰胺酸 L-Asparagine C4 L-苯基丙氨酸 L-Phenylalanine D4 L-丝氨酸 L-Serine E4 L-苏氨酸 L-Threonine F4 甘氨酰基-L-谷氨酸 Glycyl-L-Glutamic Acid G4 苯已基胺 Phenylethyl-amine 胺类化合物 Amines H4 腐胺 Putrescine EcoPlate碳源基质类型10 g土壤土壤90 ml无菌水无菌水4振荡振荡1 h（200 rpm/min）取上清液用无菌水做成取上清液用无菌水做成10-3的土壤稀释液的土壤稀释液吸取吸取150 l 接种至接种

14、至ECO板的微孔中板的微孔中在在Emax自动读盘机上自动读盘机上 每每24 h 读取一次读取一次590 nm 处处光密度值，直至不再变化。光密度值，直至不再变化。25 下培养下培养72hBIOLOG 测定步骤测定步骤采用孔平均染色程度法(Average Well Color Development,AWCD)或曲线积分法(CI)，得出终点数据的标准转换值，AWCD或CI。AWCD=(C-R)/n C：每一个微孔的光密度值R：空白微孔的光密度值n：碳源底物的数目(ECO板 n=31)根据培养时间计算每一个样品的总平均AWCD值；应用主成分分析(PCA)比较不同的样本数据分析数据分析箭头所指的是土

15、壤化箭头所指的是土壤化学和物理性状学和物理性状BD:容重容重;DP:入渗空入渗空隙隙;EC:电导率电导率;AWC:有效水容量有效水容量;N:氮氮;OMC:有机质含有机质含量；量；SP：饱和率：饱和率;PW:孔隙水孔隙水土壤微生物群落结构以及物理化学土壤微生物群落结构以及物理化学性状受污水灌溉的影响性状受污水灌溉的影响 Waste water treated control主成份分析主成份分析 土壤加入不同浓度的Hg培养一周后，在 31种单独碳源基质上最大显色速率;主成份1和2分别解释总变异的 41.1%和17.4。(Mller et al.,2001.FEMS Microbiology Let

16、ters,204,49-53)应用实例-微生物群落对土壤中Hg响应主成份1主成份2测试板微孔中Hg(II)(mg ml-1)1 0预培养时土壤中Hg(II)(mg g-1)02.51025v优点简单、快速，适用于大量样品的测定尤其适合对于根际微生物群落结构的分析v局限性 只适用于可培养的微生物 选择性测定能利用简单基质快速生长的微生物不适于森林土壤 常用的Ecoplate平板中碳源物质缺乏纤维素、半纤维素、木质素、几丁质等森林土壤中常见的有机物质Biolog 方法评价方法评价基于PCR 16S rRNA分析 利用荧光染色显微镜镜检发现每克土壤或水体沉积物可含有1010 个细菌 而利用琼脂板分离

17、到的细菌在森林土壤中仅占0.1-1%，在农田土壤中也不过10%；利用分子生物学技术可以分析包括不可培养的微生物在内的整个土壤微生物群落结构；rDNA扩增及限制性位点分析(ARDRA)Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis 通过PCR扩增、克隆可探测到已知和未知的DNA序列，但每克土中有4000多种微生物，分析每个土壤样本要测序几千个序列，非常耗时，利用ARDRA 提取土样中DNA;利用一定的标记引物(如荧光)对样品中的DNA进行特异扩增；然后进行限制性内切酶酶解,获得末端限制性片段TRFs；电泳分离片段，检验TRFs的多样性；利用主成份分析比较

18、不同样本的末端限制性片段的特征多聚酶链反应-变性或温度梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE/TGGE)Denaturing/Temperature Gradient Gel Electrophoresis 使用1对特异性引物，利用PCR扩增微生物自然群体的16S/18S rRNA基因;产生长度相同但序列不同的DNA片段的混合物，然后用DGGE分离；所得环境样本的特异性DGGE条带，经切胶，再进行PCR扩增特异性DNA片段直接测序或经DNA克隆、测序；进行系统发育分析，构建遗传相似性图谱，以揭示微生物多样性演变的内在机制 CsCl/ethidium bromide 密度梯度平衡离心法分离同位素标记

19、的密度梯度平衡离心法分离同位素标记的DNAa:从利用 12C-或 13C-methanol 作惟一碳源纯培养的M.extorquens AM155 提取的DNA；b,c:分离前后从加入12C-or 13C-methanol作惟一碳源的土壤中提取出的DNA Bar:1cm(Radajewski et al.,2000 Nature 403,646-649稳定同位素探针技术从一系列单个基因组序列分析推断它们在环境中相互作用Kowalchuk,2005测定特定环境基因组序列测定特定环境基因组序列并利用技术和试验设计降低复杂程度生物多样性指标Alpha()多样性 特定区域、群落或生态系统中生物多样性，

20、一般用物种丰富度表示；Shannon 指数 H=-SPilnPi(i=1 to S)S:物种数；Pi=ni/N:第i个物种个体(ni)占全部个体N比例。是communication entropy Simpson 指数 D=1-SPi2(i=1 to S)Pi2=ni(ni-1)/N(N-1);0D 1,接近1说明生物多样性高，或环境空间异质性大，而近于0说明多样性小 Beta -diversity =(S1 c)+(S2 c)S1,S2分别是两个群落的物种数；c 在两个群落中都有的物种数，可用来比较生态系统或表征环境梯度的影响；Srensens similarity index b=2c/(

21、S1+S2)参考文献参考文献 1)Firestone M.,Balser T.,Herman D.Defining soil quality in terms of microbial community structure.Annual Reports of Research Projects,UC Berkeley,1997 2)Garland J L.,Mills A L.Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of commun

22、ity level sole carbon source utilization.Appl.Environment Microbiology,1991,57:2351-2359 3)Garland J L.Analytical approaches to the characterization of samples of microbial communities patterns of potential C source utilization.soil biology biochemistry,1996,28:21322 4)Muller A.K.,Rasmussen L.D.,Srensen S.J.Adaptation of the bacterial community to mercury contamination.FEMS Microbiology Letters 2001,204:49-53 5)Zelles L.Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in thecharacterisation of microbial communities in soil:a review.Biol Fertil Soils 1999,29:111129