当酶标半抗原与抗体结合后课件.ppt

1、第五课第五课 酶免疫技术；胶体金技术酶免疫技术；胶体金技术 临床免疫实验室临床免疫实验室 张君龙张君龙2018第五课（第一部分）第五课（第一部分）酶免疫技术酶免疫技术酶免疫技术特点ELISA 的原理和类型ELISA 的技术要点 以酶标记抗体或抗原作为主要试剂，利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测的敏感性的一种标记分析技术，称为酶免疫技术酶免疫技术（enzyme immunoassay，EIA）一、酶免疫技术的定义和特点酶免疫技术酶免疫技术一般由两部分组成：一般由两部分组成：1.抗原+抗体 IC（酶标抗原或抗体参与）2.底物 显色 色泽程度色泽程度与IC中的酶活性

2、及数量酶活性及数量相关，颜色深浅可确定待测抗原或抗体存在存在或含量含量特点特点:免疫反应的高特异性酶(专一性)催化反应的高效性及高灵敏度抗体或抗原上的酶抗体或抗原上的酶酶免疫组化技术酶免疫组化技术酶免疫测定技术酶免疫测定技术二、酶免疫技术的分类固相酶免疫测定固相酶免疫测定(ELISA)均相酶免疫分析又叫勿需分离的酶免疫分析，酶标抗原酶标抗原与抗体抗体结合后，其中的酶活性将被减弱或增强酶活性将被减弱或增强，因此不需分离即可测定反应系统中酶活性的变化酶活性的变化，从而推算出待测物的含量。1、均相酶免疫分析技术标本抗原标本抗原酶增强免疫测定技术示意图（酶增强免疫测定技术示意图（EMIT）EMITEM

3、IT的基本原理及特点：的基本原理及特点：半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制（图使酶的活性中心受到影响而活性被抑制（图A A）。）。从从酶活性的测定酶活性的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。结果就可推算出标本中半抗原的量。标本抗原浓度与显色程度成正比。标本抗原浓度与显色程度成正比。应用：主要用于检测小分子激素和半抗原（如：药物）异相酶免疫分析要求，酶标抗原酶标抗原与抗体抗体结合后，需采用适当的方法

4、分离游离的和抗原（或抗体）结合复合物-酶标记物，测定底物显色程度，从而推算出待测物的含量。2、异相酶免疫分析技术异相液相酶免疫分析异相液相酶免疫分析固相酶免疫分析固相酶免疫分析ELISAELISA以检测抗原为例：以检测抗原为例：3、ELISA 的原理和类型E酶标抗体酶标抗体固相抗体固相抗体固相载体固相载体待测抗原待测抗原ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay(酶联免疫吸附试验)1.1.2.3.2.3.顾名思义，由两个抗体夹一个抗原形成“三明治三明治”复合物，来检测抗原的方法，仅适合于至少含两个抗原决定簇的多价抗原检测。1.双抗体夹心法双抗体夹心法E酶标酶

5、标抗体抗体固相固相抗体抗体固相载体固相载体待测抗原待测抗原1.1.抗体（检测抗原）抗体（检测抗原）2.2.加样本、孵育、洗涤加样本、孵育、洗涤3.3.加酶结合物、孵育、洗涤加酶结合物、孵育、洗涤4.4.加底物液、终止液、比色加底物液、终止液、比色E E检测抗原检测抗原E EE E Colorless 阴阴 性性阳阳 性性OD浓度底物液、终止液底物液、终止液应用：应用：如：乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、细胞因子、肿瘤标志物AFP、CEA等的测定 在双抗体夹心法的基础上发展而来，所检测抗原有两个不同两个不同的抗原决定簇，两种针对不同抗原决定簇的单克隆抗体可同时同时和抗原反应，生成夹心式“三明治”复合

6、物。2.双位点一步法双位点一步法双位点一步法测抗原示意图双位点一步法测抗原示意图 钩状效应（钩状效应（hook effect）当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量，严重时甚至可出现假阴性结果。（类似于沉淀反应中抗原过剩的后带现象）应用应用如：乙型肝炎表面抗原的检测（HBsAg）测定抗原：受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。3.AgE+Ab AgEAb AgAbAg+竞争法示意图竞争法示意图 所谓间接法是指利用酶标记的抗抗体（即二抗）来检测与固相抗原结合的抗体。1.间接法

7、检测抗体示意图间接法检测抗体示意图1.Antigen coating2.Sample(human antibody)3.Anti-(human)Ig-enzyme E E E4.Substrate5.Stop solution 国际通用的标准板形是国际通用的标准板形是8X12的的96孔孔式式附：附：酶标仪图酶标仪图附：附：OD值值antibody吸光度与抗体浓度标准曲线吸光度与抗体浓度标准曲线 只要更换不同的固相抗原，用一种酶标抗抗体一种酶标抗抗体就可检测出各种相应的抗体。人体内多种自身抗体检测，如：抗CCP抗体、抗心磷脂抗体等2.竞争法竞争法抗体的检测一般不采用竞争法。抗体的竞争法测定不同于

8、单个抗原决定簇的小分子抗原的竞争法。测定可靠性受竞争抗体的特异性和亲和力影响。亲和力的差异易造成部分无法解释的结果。E酶标酶标Ab待测待测AbHBeAb竞争法（传统）竞争法（传统）固相固相Ag固相固相Ab待测待测Ab中和中和AgE酶标酶标Ab中和中和AgE酶标酶标Ab显色强弱与显色强弱与待测含量呈反比待测含量呈反比HBeAb竞争法（改良）竞争法（改良）4.捕获法测捕获法测IgM抗体抗体 血清中某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定 捕获法：先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，再测定特异性IgM。捕获法测捕获法测IgM抗体示意图

9、抗体示意图 应用：应用：如：检测乙肝IgM型抗体捕获法测IgM抗体实际上夹心法的两次运用RF的干扰的干扰6.BAS-ELISA（参见相关章节）（参见相关章节）SystemBAS-ELISA法示意图法示意图 待检标本待检标本应用应用 由于BAS-ELISA法的放大作用，可对体内含量极微的物质进行检测，例如：细胞因子、粘附分子等的检测。不同试剂生产厂家，测定同一种物质而设计ELISA方法可有所不同，但都是在以上几种经典方法的衍化和变通。三、ELISA 的技术要点 试剂制备反应条件的选择操作的标准化1.试剂制备试剂制备酶标记抗体或抗原也称为结合物(conjugate)要求：要求：抗原纯度高、抗原性完

10、整 抗体特异性好,效价高,亲和力强,比活性高 用于ELISA的抗体有多克隆和单克隆，效果为：Fab段 单克隆 多克隆 最常用固相载体ELISA最常用载体：最常用载体：聚苯乙烯 膜载体:硝酸纤维素膜聚苯乙烯聚苯乙烯优点：优点：较强吸附蛋白质的性能 抗体或抗原能保留免疫活性 聚苯乙烯可制成各种形状 缺点：缺点：包被液pH在9.0左右为宜，小于6.0时非特异性吸附增多。抗原或抗体固相化抗原或抗体固相化包被(coating)：将抗原或抗体固相化的过程 封闭(blocking)：用1%5%牛血清白蛋白或5%20%小牛血清再包被一次，可减小或消除本底包被板的保存：4、干燥、密封酶的主要要求常用的酶及其底物

11、用于标记的酶应符合以下条件：用于标记的酶应符合以下条件：酶催化效率高 具有可与抗原或抗体共价结合的基团 标记后酶不影响抗原抗体的免疫反应性 标记后酶不影响酶催化活性 抗原抗体反应的最适pH时，酶的活性稳定 酶对人体无害，价廉易得酶活性：酶活性：指1min将1mol底物转化为产物所需的酶量常用酶：常用酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）HRP的特点：的特点：1）分子量小，标记后较稳定2）pH稳定范围宽，3.212都能催化反应3）水溶解度好，可配制较高的酶结合物浓度AP的特点：的特点：高纯制品难得,稳定性及酶标记物收率低,价格较高 戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基醛基，可分别

12、与HRP和抗体蛋白分子中的氨基氨基反应形成结合物，将两个分子以五碳桥连接起来。改良过碘酸钠法 HRP中的多糖羟基多糖羟基被氧氧化化成活泼的醛基醛基，后者即可与抗体蛋白中的游离氨基氨基形成Schiff碱而交联，再经硼氢化钠还原终止反应，即得到稳定的酶标结合物。制备抗体酶结合物用方法：制备抗体酶结合物用方法：无色、无味、无毒、性质稳定呈色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成正比至少应有一种能终止酶反应的试剂光照不影响底物和产物的稳定性价廉易得 常用酶及其底物辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AP）作用底物邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-N

13、PP）颜色橙黄色橙黄色黄色黄色黄色黄色最大吸收峰492nm450nm405nm特点OPD稳定性差，需新鲜配制，需避光，有致癌性TMB稳定性好，不需避光，无致突变作用，水溶性稍差AP高纯制品难得，稳定性及酶标记物收率低，价格较高 常为浓酸 或 浓碱 建立某一ELISA测定，应对包被抗原包被抗原或抗体的浓度或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度酶标抗原或抗体的浓度予以选择，选择阳性结果吸光度值在1.0左右，阴性结果小于0.2的最高稀释度为合适浓度。2.反应条件的选择反应条件的选择3.3.测定方法的标准化测定方法的标准化 试剂盒的标准化生产由厂家在生产试剂盒时进行测试完成 检测的标准化由工作人员进行，应

14、力求各个操作步骤的标准化(a)加样(b)pH值(c)温度(d)孵育时间(e)洗涤(f)比色标准化操作程序（标准化操作程序（SOP）ELISAELISA全自动化检测仪全自动化检测仪 酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，它的最小检测限为ng甚至pg水平。四、酶免疫测定的应用1将Fab或F(ab)2片段与固相载体交联，提高测定的特异性。2过量抗体的非竞争法将逐步取代限量抗体的竞争法，前者的灵敏度和可测范围至少可比后者大6-10倍。3随着酶免疫技术与放大系统及自动化原理相结合，使酶免疫分析检测更敏感、更特异、更客观、更准确。五、发展趋势小 结酶免疫技术定义酶免疫技术的分类ELISA 的原理和类型ELI

15、SA 的技术要点膜载体的酶免疫测定酶免疫测定的应用主要内容主要内容固相膜免疫分析技术(solid phase membrane-based immunoassay)是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜，也可以通过毛细管作用在膜上向前移行的特性，以酶或各种有色微粒子（如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等）标记抗体或抗原，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的检验方法。胶体金免疫技术胶体金免疫技术 斑点酶免疫吸附试验 免疫印迹试验第五课（第二部分）胶体金技术第五课（第二部分）胶体金技术 胶体金免疫技术 胶体金标记胶体金标记 +抗原抗体反应抗原抗体反应u免疫电镜技术u光镜染色技术u蛋白质染色技术u流

16、式细胞术u斑点免疫金渗滤试验u斑点免疫金层析试验（colloidal gold immunoassay）一、胶体金与免疫金的制备胶体特性：胶体特性：胶体金（colloidal gold）金溶胶，是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。金溶胶，是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。n 1100 nm大小n 稳定n 均匀n 单一分散状n 对电解质敏感胶体金的特性：呈色性和光吸收性：呈色性和光吸收性：胶体金颗粒胶体金颗粒大小大小(nm)呈色呈色吸收峰波吸收峰波长长(nm)16酒红色51824.5橙红色52241红色52571.5紫红色535稳定性：稳定性：介于小分子离子溶液和粗分散相之间影响因素：

17、n 胶体金胶粒间的相互吸引力n 胶体金胶粒及其溶剂化层的带电情况n 胶体界面的溶剂膜胶体金的特性：聚沉现象：聚沉现象：胶粒间吸引力超过排斥力时，胶粒聚集使颗粒直径变大，超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象。引起因素：n 电解质n 温度n 浓度制备原理：制备原理：n 0.01%氯金酸水溶液100 ml，加热至沸腾n 磁力搅拌，准确加入1%柠檬酸三钠水溶液2 mln 继续煮沸15分钟n 冷却后加蒸馏水恢复至原体积胶体金的制备：氯金酸（HAuCl4）还原剂：柠檬酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠 聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。技术要点：技术要点：2分钟后：灰色黑色酒红色注意事项

18、：注意事项：n 粒径大小：颜色、最大吸收波长、电镜检测n 粒径均一程度：测定100个以上的胶体金颗粒，统计分析平均直径（颗粒大小）及标准差（均一性）n 有无凝集颗粒：应清亮透明，若浑浊或有漂浮物，提示制备的胶体金有较多凝集颗粒。1.氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。1%氯金酸水溶液在4可保存数月；2.氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，配制时避免接触金属；3.制备用高质量水：双蒸水、三蒸水或去离子水4.制备用玻璃容器必须绝对清洁（最好经硅化处理：用含5%二氯甲硅的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用）鉴定：鉴定：保存：保存：n 玻璃容器n 室温、避光 3个月左右，4半年，避免低温冻存n 最好在制备

19、完毕后20天以内进行标记。胶体金的制备：制备原理：制备原理：免疫金：胶体金+抗原或抗体胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质表面带正电荷的基团借静电吸附而形成牢固的结合。胶体金的制备：1.胶体金溶液pH的调整2.待标蛋白质最适标记量的确定3.标记过程4.金标记物的纯化技术要点：技术要点：被标记物被标记物IgGMcAb亲和层析亲和层析AbSPAConA亲和素亲和素最适pH值9.08.27.65.96.28.0910在磁力搅拌下，将蛋白溶液逐滴加入到胶体金溶液中，数分钟后加入一定量的稳定剂（5%牛血清白蛋白或1%聚乙二醇20000）u 目的：去除未标记的蛋白、未充分标记的胶体金、标记过程中形成的聚合物u

20、方法：超速离心法、凝胶过滤法1.在调节胶体金的pH时，先用终浓度为0.1%的聚乙二醇（PEG20000）稳定胶体金后，再插入电极到胶体金溶液中测定pH。2.蛋白质溶液标记前，先用低浓度盐水透析数小时，并高速离心去除聚合物。注意事项：注意事项：u 用稀释液配制成工作浓度保存u 稀释液：含稳定剂的缓冲液（PBS、Tris缓冲液）u 稳定剂：PEG、BSA常用u 加入50%甘油、-18可保存1年以上免疫金的保存：免疫金的保存：二、胶体金免疫技术的方法学种类与原理n（一）斑点金免疫渗滤试验n（二）斑点金免疫层析试验原理：原理：（一）斑点免疫金渗滤试验：Ag或Ab标本 免疫金 洗涤液阳性反应呈现红色斑点

21、硝酸纤维素膜双抗体夹心法方法类型：方法类型：间接法待测抗原待测抗原胶体金胶体金 标记抗体标记抗体包被抗体包被抗体NC膜膜包被抗原包被抗原胶体金胶体金 标记二抗标记二抗待测抗体待测抗体NC膜膜操作要点：操作要点：试剂盒组成：1.渗滤装置（反应板）2.胶体金标记物3.洗涤液操作要点：1.平放反应板，于小孔内滴加待测标本12，待完全渗入；2.滴加免疫金试剂12滴，待完全渗入；3.滴加洗涤液23滴，待完全渗入；4.结果判断：膜上显示淡红色或红色斑点为阳性，无颜色显示为阴性，颜色深浅提示阳性程度。双抗体夹心法方法类型：方法类型：竞争法胶体金免疫层析试验（GICA）：原理：原理：胶体金技术+蛋白质层析技术

22、方法类型：方法类型：间接法技术要点：技术要点：试剂盒组成：胶体金层析条操作要点（以双抗体夹心法为例）：1.将试剂条标记线一端浸入待测标本中25秒，或在加样处加一定量的待检标本，水平放置；2.520分钟内观察结果；3.结果判断：出现一条棕红色条带为阴性（保证带），出现两条棕红色条带为阳性；无保证带出现为试剂失效。临床应用评价：临床应用评价：1.免疫金测定技术特点u简单、快捷、操作人员不需培训简单、快捷、操作人员不需培训u无需特殊仪器设备无需特殊仪器设备u试剂稳定，便于保存试剂稳定，便于保存u特别适用于床旁检验特别适用于床旁检验2.免疫金测定技术灵敏度问题u定性和半定量试验，不能准确定量。定性和半

23、定量试验，不能准确定量。u敏感性不及酶标法和酶发光免疫测定法敏感性不及酶标法和酶发光免疫测定法3.免疫金测定技术临床应用u用于检测正常体液中不存在的物质（如传染病用于检测正常体液中不存在的物质（如传染病Ag/AbAg/Ab、毒麻类药物）、毒麻类药物）u检测正常含量极低，却在特殊情况下异常升高的物质（如人检测正常含量极低，却在特殊情况下异常升高的物质（如人-HCG-HCG）固相膜免疫分析技术(solid phase membrane-based immunoassay)是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜，也可以通过毛细管作用在膜上向前移行的特性，以酶或各种有色微粒子（如彩色胶乳、胶体

24、金、胶体硒等）标记抗体或抗原，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的检验方法。胶体金免疫技术（胶体金免疫技术（本节课部分）本节课部分）斑点酶免疫吸附试验 免疫印迹试验小结小结：英语词汇 enzyme immunoassay，EIA ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)coating blocking conjugate hook effect BAS-ELISA（Biotin-Avidin system)ABC(Avidin-Biotin complex)colloidal gold immunoassayTips The enzyme-linked

25、immunosorbent assay(ELISA)is a test that uses antibodies and color change to identify a substance.ELISA is a popular format of wet-lab type analytic biochemistry assay that uses a solid-phase enzyme immunoassay(EIA)to detect the presence of a substance,usually an antigen,in a liquid sample or wet sa

26、mple.The ELISA has been used as a diagnostic tool in medicine,as well as a quality-control check in various industries.Antigens from the sample are attached to a surface.Then,a further specific antibody is applied over the surface so it can bind to the antigen.This antibody is linked to an enzyme,and,in the final step,a substance containing the enzymes substrate is added.The subsequent reaction produces a detectable signal,most commonly a color change in the substrate.