常用的定量PCR荧光探针-生物化学与分子生物学课件.ppt

1、1生物系统中生物系统中mRNAmRNA或或DNADNA等目标核酸分子的分析鉴定等目标核酸分子的分析鉴定必须回答如下三个基本问题：必须回答如下三个基本问题：目标核酸分子是否存在于实验标本中。目标核酸分子是否存在于实验标本中。实验标本中目标核酸分子的含量是多少实验标本中目标核酸分子的含量是多少。实验标本中目标核酸分子的序列如何；以及与其他实验标本实验标本中目标核酸分子的序列如何；以及与其他实验标本中的情况比较，目标核酸分子的序列是否有变化。中的情况比较，目标核酸分子的序列是否有变化。核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 12证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法：证明目标核酸分子

2、是否存在于实验标本中的基本实验方法：1 1）杂交法，）杂交法，2 2）PCRPCR法，法，3 3）测序法。）测序法。核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 131)1)杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。qDot blottingDot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体上，针对目标上，针对目标DNADNA分子或分子或RNARNA分子进行杂交检测。分子进行杂交检测。qSouthern blottingSouthern blotting：在电泳后，针对

3、目标：在电泳后，针对目标DNADNA分子的杂交检测。分子的杂交检测。qNorthern blottingNorthern blotting：在电泳后，针对目标：在电泳后，针对目标RNARNA分子的杂交检测。分子的杂交检测。q目标目标DNADNA分子原位杂交检测。分子原位杂交检测。q目标目标RNARNA分子原位杂交检测。分子原位杂交检测。核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 14杂交法的优点与缺点：杂交法的优点与缺点：q优点：优点：Dot blotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。：简单实用，适于进行大样本数同时检测。Northern blotting：如果检测结果阳性，其可信

4、度要远远高于：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的，因此被誉为评价基因转录的Golden Marker。Southern blotting：对：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强。病毒类病原体等的检测实用性很强。q缺点：缺点：Dot blotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核酸分子的

5、结合，因此酸分子的结合，因此将将可能可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结导致阳性结果放大，甚至是假阳性结果。果。Northern blotting：对低拷贝对低拷贝mRNA有时检测不出来，容有时检测不出来，容易导致假阴性结果。易导致假阴性结果。核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 15例一：例一：cDNA microarray检测检测SHEEC食管食管癌细胞癌细胞NGAL基因基因mRNA转录实验转录实验结果结果反向反向 Dot blotting核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 16例二：例二：Northern blotting检测检测SHEEC食管癌食管癌细胞细胞NGAL基因基

6、因转录转录mRNA实验实验结果结果NGAL 化学发光法核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 17例三：例三：Northern blotting 检测缺检测缺氧复氧条件下心氧复氧条件下心肌细胞肌细胞EGR1基基因转录因转录mRNA 实实验结果验结果EGR1 同位素法核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 18确保杂交法实验确保杂交法实验成功成功的八个关键点：的八个关键点：q关键点关键点1：确保实验方案设计合理。：确保实验方案设计合理。q关键点关键点2：确保探针的特异性充分。：确保探针的特异性充分。q关键点关键点3：确保检测的灵敏度足够高。：确保检测的灵敏度足够高。q关键点关键点4：确保

7、样本质量合格。：确保样本质量合格。q关键点关键点5：确保实验试剂质量合格。：确保实验试剂质量合格。q关键点关键点6：确保实验过程规范。：确保实验过程规范。q关键点关键点7：对于编码序列的：对于编码序列的cDNA，要确保没有，要确保没有RNA的干扰。的干扰。q关键点关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证，：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证，确保实验结果可靠。确保实验结果可靠。核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 192)2)PCRPCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术

8、进展1 1q优点：优点：实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统中所存在的中所存在的1个拷贝目标核酸分子。个拷贝目标核酸分子。阴性结果的可信度很阴性结果的可信度很高。高。q缺点：缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实，过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实，因此，其阳性结果的可信度不如因此，其阳性结果的可信度不如Northern boltting 或或 Southern boltting。10例子：例子：RT-PCR检测检测SHE

9、EC食管癌食管癌细胞细胞NGAL基因基因转录转录mRNA实验实验结果结果NGAL 600bpS M S:食管癌细胞食管癌细胞SHEECM:DNA marker核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 111核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1确保确保PCRPCR法实验法实验成功成功的八个关键点：的八个关键点：q关键点关键点1：确保实验方案设计合理。：确保实验方案设计合理。q关键点关键点2：确保引物的特异性充分。：确保引物的特异性充分。q关键点关键点3：确保样本质量合格。：确保样本质量合格。q关键点关键点4：确保实验试剂质量。：确保实验试剂质量。q关键点关键点5：确保实验过程规范。：

10、确保实验过程规范。q关键点关键点6：确保：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。变性、退火和延伸温度适度。q关键点关键点7：对于编码序列：对于编码序列cDNA，要确保没有，要确保没有RNA的干扰。的干扰。q关键点关键点8：几种：几种PCRPCR法法，或，或PCRPCR法法与其它方法联合使用，相互印证，与其它方法联合使用，相互印证，确保实验结果可靠。确保实验结果可靠。12核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 13)3)测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含致大小，而且是对照生

11、物系统中不存在，或者两者相比在含量上可能有显著差别，然而序列未知。量上可能有显著差别，然而序列未知。q优点：优点：可信度最高。可信度最高。对于解析鉴定未知核酸分子对于解析鉴定未知核酸分子序列片序列片段是必需的手段段是必需的手段。q缺点：目标缺点：目标片段片段边缘序列边缘序列的的测定结果有时不准确，在读原初测定结果有时不准确，在读原初测序图时要格外小心测序图时要格外小心。13核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1目标目标片段片段边缘序列边缘序列的的测定结果有时不准确测定结果有时不准确例子例子14Poly A tail核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 115核酸实验研究技术进展核

12、酸实验研究技术进展1 116核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1测定实验标本中目标核酸分子的含量测定实验标本中目标核酸分子的含量17核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1通过通过 Dot blottingDot blotting，结合斑点光密度扫描分析，结合斑点光密度扫描分析，测定实验标本中目标测定实验标本中目标mRNAmRNA分子、目标分子、目标cDNAcDNA分子或分子或目标目标DNADNA分子的含量分子的含量18A永生化食管永生化食管上皮细胞上皮细胞SHEEB食管癌细胞食管癌细胞SHEEC例子：例子：cDNA microarray（反向（反向 Dot blotting）

13、检测检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中中 NGAL基因转录基因转录mRNA相对含量实验结果相对含量实验结果判断标准：判断标准：B/A 2或或 0.5为显著性为显著性差异表达差异表达实际情况：实际情况：B/A3.53核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 119核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1通过通过 RT-PCRRT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标标本中目标mRNAmRNA分子或目标分子或目标cDNAcDNA分子的含量分子的含量20例子：例子：RT-PCR 检测检测SHEE

14、C食管癌细胞与永生化食管上皮食管癌细胞与永生化食管上皮细胞细胞SHEE中中 NGAL基因转录基因转录mRNA相对含量实验结果相对含量实验结果NGAL 600bpA B M A:永生化食管上皮细胞永生化食管上皮细胞SHEEB:食管癌细胞食管癌细胞SHEECM:DNA markerA B M GAPDH 226bp核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 121两个问题：两个问题：反转录反转录PCRPCR实验是否需要探针实验是否需要探针？反转录反转录PCRPCR的特异性如何保证的特异性如何保证？核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 122核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1通过通

15、过 Northern blottingNorthern blotting，结合条带光密度扫描分，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标析，测定实验标本中目标mRNAmRNA分子的含量分子的含量23例一：例一：Northern blotting Northern blotting 检测检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮食管癌细胞与永生化食管上皮细胞细胞SHEE中中 NGAL基因转录基因转录mRNA相对含量实验结果（相对含量实验结果（化学发光化学发光）NGAL A BA:食管癌细胞食管癌细胞SHEECSHEECB:永生化食管上皮细胞永生化食管上皮细胞SHEESHEEA BGAPDH A

16、BA B500-400-300-200-100-100-80-60-40-20-核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 124核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1例二：例二：Northern blotting 检测缺氧复氧条件下心肌细胞检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1基基因转录因转录mRNA 相对含量实验结果相对含量实验结果(同位素标记法)1 正常2 缺氧复氧3 缺氧复氧溶剂对照4 缺氧复氧F25 缺氧复氧钙离子拮抗剂1 2 3 4 5 1 2 3 4 5EGR1 -Actin 25核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1通过通过 Southern blotting So

17、uthern blotting，结合条带光密度扫描分，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标析，测定实验标本中目标DNADNA分子的含量分子的含量26核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1通过通过 Southern blotting Southern blotting，结合条带光密度扫描分，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标析，测定实验标本中目标DNADNA分子的含量分子的含量27核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）是一种 较好的mRNA定量检测技术。RPA的各项实验指标均优于Northern Blotting。运用RPA

18、可实现对目标RNA分子的高通量定量检测。核糖核酸酶保护分析核糖核酸酶保护分析Ribonuclease Protection Assay(RPA)核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 128原理原理：以目标基因DNA为模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放射法）作为标记信号，体外转录合成反义RNA探针。将过量的反义RNA探针与样品总RNA杂交，然后进行核糖核酸酶处理。未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解，而目标RNA则因与探针结合形成双链而被保护。杂交双链进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或化学发光等方法确定目标RNA的量。核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1

19、29核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 130核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1适时荧光定量PCRReal time fluorescent quantitation PCR31适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性定量或半定量分析 适时荧光定量PCR技术：通过一个特殊的荧光探针，对PCR扩增反应中每一次循环的产物进行适时跟踪定量分析 核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 132real time PCR real time PCR 的扩增曲线的扩增曲线核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 133PE公司在同一台

20、PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图Ct值极具重现性核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 134Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号值与模板数成正比固定荧光信号值后，循环数与初始模板数成反比。初始模板数越多,荧光信号达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少起始模板浓度的对数与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的初始模板数。0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRnThreshold104103102核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 135常用的定量常用的定量PC

21、RPCR荧光探针荧光探针SYBR Green I Taqman水解探针分子信标核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 136SYBR Green Iv 结合到双链DNA的小沟部位v 只有和双链DNA结合后才发荧光核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 137SYBR Green I 工作原理未结合的SYBR green I核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 138SYBR Green I的优点价格相对便宜使用简便可以用于不同的模板灵敏度很高SYBR Green I的缺点特异性较差核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 139TaqMan Probes荧光素淬灭剂 与目标序列

22、互补FAMTETJOEHEXVIC TAMRA DABCYL 核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 140TaqMan Probes工作原理探针与目标序列配对，荧光基团与荧光淬灭剂相邻，不发生特异荧光能量转移Taq游离的探针荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，荧光基团与荧光淬灭剂分离，发出特异荧光。Taq发出特异荧光光另一波长的荧光核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 141TaqMan Probes的优点：定量关系准确。随着扩增循环数增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团成倍增加，荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。TaqMan探针特别适合于病毒定量、基因转录水平定量、

23、癌细胞基因微突变检测等。敏感性高。特异性高。TaqMan Probes的缺点：只适合于一个特定目标的检测。核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 142分子信标(发夹型杂交探针)荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补(5-7bp)环（15-30bp）FAM Texas Red 核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 143分子信标工作原理探针与DNA模板杂交光发出荧光发出荧光荧光基团单链DNA 模板环光核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 144分子信标优点：分子信标能特异性地检测目标DNA 分子信标可用于单核苷酸多态性的检测 特别适用于检测点突变分子信标的缺点只能用于一个特定的目标设计困难价格较高核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 145ABI Prism 7700o可以在同一反应体系中同时对多个靶DNA或cDNA分子进行扩增检测o一次可以测定96个样本o速度较快，一批样本的完成只需要23小时o可应用水解探针、双链DNA结合染料和分子信标等o不能实时对扩增结果进行分析，只能在全部扩增结束后再进行数据分析核酸实验研究技术进展核酸实验研究技术进展1 1