氨基酸的分离鉴定-纸层析法课件.ppt

1、生物化学实验室生化小老师团队氨基酸的分离鉴定纸层析法3，5二硝基水杨酸比色法测还原糖和总糖含量氨基酸的分离鉴定纸层析法实验目的实验原理实验试剂与仪器实验步骤注意事项实验结果与分析实验目的1掌握氨基酸纸层析法的原理2熟悉纸层析法的实验操作3分离鉴别未知氨基酸样品的成分。实验原理 纸层析 纸层析法属于分配层析，层析滤纸为载体，流动相是指层析液，在毛细拉力作用下，层析液能不断由下向上流动。固定相是指被吸附在滤纸纤维之间的水分。由于纤维素上的羟基具亲水性使这部分水束缚在纤维素周围，不易扩散而成为固定相。实验原理 在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经滤液滴点时，滴点上的氨基酸就相继融入层析液

2、，随着层析液上升，并发生在分配，即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，那些分配系数大的氨基酸分子，随层析液向上移动得快，形成的斑点集中在滤纸的上部；而分配系数小的氨基酸分子，随层析向上移动得慢，形成的斑点集中在滤纸的下面。实验原理分配系数 指一定温度下,处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。在同一实验条件下，比移值Rf主要取决于分配系数，不同的物质分配系数不同，也就有不同的Rf。此外，溶剂的溶质的性质、滤纸的性质、展层的温度和p H值均

3、会影响比移值Rf。在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经滤液滴点时，滴点上的氨基酸就相继融入层析液，随着层析液上升，并发生在分配，即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，那些分配系数大的氨基酸分子，随层析液向上移动得快，形成的斑点集中在滤纸的上部；而分配系数小的氨基酸分子，随层析向上移动得慢，形成的斑点集中在滤纸的下面。Rf=原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离实验原理 茚三酮的显色原理 氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫

4、色化合物，称为罗曼紫（Ruhemanns purple）。实验试剂与仪器 试剂 纯净的赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸810E-3mol/L溶液；四种氨基酸混合溶液（每种浓度与对应纯净溶液一致）；2.5%茚三酮丙酮溶液；酸性展层剂（正丁醇：88%甲酸：水=60：17：8）。仪器 钟罩1、培养皿1、小烧杯10ml1、层析柱1、小漏斗1、新华一号滤纸（14cm17cm）1、电吹风、烘箱、毛细管、订书机，及其他常用仪器。实验步骤点样平衡层析显色 点样点样 取洁净滤纸一张，在距底边取洁净滤纸一张，在距底边2cm2cm线上取五线上取五个点（每两点相隔距离个点（每两点相隔距离2cm2cm），分别用毛细），

5、分别用毛细管将各氨基酸样品点在五个点上，点样大管将各氨基酸样品点在五个点上，点样大小以直径小以直径3mm3mm左右为宜，不要超过左右为宜，不要超过5mm5mm，冷，冷风吹干，重复点样一次，吹干。风吹干，重复点样一次，吹干。实验步骤实验步骤 平衡平衡 将滤纸卷成柱状将两边缘对齐（将滤纸卷成柱状将两边缘对齐（注意不注意不要让两端接触，造成层析液上升高度不一要让两端接触，造成层析液上升高度不一致致），并用订书机订好，将滤纸竖直放置），并用订书机订好，将滤纸竖直放置在洁净的培养皿中（在洁净的培养皿中（不要接触培养皿壁不要接触培养皿壁），），旁边摆放一个内盛展开剂的小烧杯，盖上旁边摆放一个内盛展开剂的小

6、烧杯，盖上钟罩平衡钟罩平衡30min30min。实验步骤 层析层析 平衡结束后，打开钟罩上端塞子，通过平衡结束后，打开钟罩上端塞子，通过已润洗的已润洗的“漏斗漏斗层析柱层析柱”装置向培养皿装置向培养皿内加入展层剂内加入展层剂303040ml40ml至液面达到培养皿至液面达到培养皿2/32/3处为宜（处为宜（层析柱不能碰到滤纸层析柱不能碰到滤纸），小心），小心抽出装置（抽出装置（不要让层析液滴落在滤纸上不要让层析液滴落在滤纸上），），盖上塞子开始层析，直到前沿达到距滤纸盖上塞子开始层析，直到前沿达到距滤纸上端上端1cm1cm刻线处（刻线处（此过程此过程2 23 3小时小时）。）。实验步骤 显色显

7、色 取出层析好的滤纸（需带手套），拆开取出层析好的滤纸（需带手套），拆开订书钉，用电吹风冷风吹干。将滤纸放入订书钉，用电吹风冷风吹干。将滤纸放入烘箱烘烤烘箱烘烤5min5min左右，待显色后取出。用铅左右，待显色后取出。用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，找到中心点，笔轻轻描出显色斑点的形状，找到中心点，测出中心点与原点水平线的距离，计算各测出中心点与原点水平线的距离，计算各种氨基酸的比移值种氨基酸的比移值RfRf，判断混合点上端各，判断混合点上端各点是什么氨基酸。点是什么氨基酸。注意事项1.整个操作过程需带手套进行，不要对着滤纸说话，以免滤纸被污染。2.点样时应注意毛细管的取放，以免污染试剂。3.

8、点样吹干时不宜吹得过干。4.柱状滤纸边缘尽量保持竖直，边缘的坡度会 影响层展的速率及效果。订的钉子上下各两颗为宜。实验结果及分析图像实例各氨基酸比移值Rf实验结果及分析氨基酸氨基酸赖氨酸赖氨酸天冬氨酸天冬氨酸丙氨酸丙氨酸亮（白）氨酸亮（白）氨酸Rf0.22940.38140.57710.8609 在同一实验条件下，比移值Rf主要取决于分配系数，不同的物质分配系数不同，也就有不同的Rf。此外，溶剂的溶质的性质、滤纸的性质、展层的温度和p H值均会影响比移值Rf。实验中，Rf值与个人操作及具体实验条件息息相关，存在一定波动，但总体趋势相同。思考问题实验结果及分析层析过程中，滤纸上前沿会出现些许黄色

9、物质，你认为这是什么？为生整个实验过程需要戴手套进行？简述你认为怎样点样可以得到较小斑点。为什么要平衡？3，5二硝基水杨酸比色法测还原糖和总糖含量实验目的实验原理实验试剂与仪器实验步骤实验结果及分析注意事项实验目的一掌握掌握DNS比色法测定糖含量的原理比色法测定糖含量的原理二熟练比色法测糖的基本操作熟练比色法测糖的基本操作三掌握分光光度计的使用方法掌握分光光度计的使用方法 实验原理 还原糖在碱性条件下加热被3，5二硝基水杨酸（DNS）氧化成糖酸及其他产物，3，5二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3氨基5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖与棕红色物质颜色的深浅成正比例关系，利用分光度计，在540nm波

10、长下测定光密度值，测绘并查对标准曲线，计算还原糖及总糖含量实验原理实验试剂与仪器 小麦面粉 3，5二硝基水杨酸（DNS试剂）：将6.3g DNS 和262mL 2mol/L NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4冰箱中保存备用。碘-碘化钾溶液、酚酞试剂、6mol/L HCL及6mol/L NaOH溶液实

11、验试剂与仪器 具塞玻璃刻度试管：20mL10、普通小试管2只、离心管：10mL2、容量瓶：50mL1，100ml1、吸量管：1mL1；2mL2、点滴板、恒温水浴锅、离心机、电子天平、分光光度计、胶头滴管、玻璃棒等其他常规仪器。实验步骤称取0.30g小麦面粉于试管中加入5ml左右蒸馏水搅拌均匀，50水浴20min水浴后，将所有溶液转移至离心管中（应尽量将试管洗涤干净），以4000r/min转速离心5min将上层清液倒入50ml容量瓶中，向盛有固体的离心管中加入适量蒸馏水重新使固液混匀，重复上步操作进行二次离心将上层清液倒入50ml容量瓶中，定容至50ml，即得到还原糖样品待测溶液实验步骤称取0.

12、10g面粉于试管中，加入1.5ml蒸馏水和1.0ml 6mol/L盐酸，摇匀，沸水浴30min水浴后，可用碘碘化钾试剂检验淀粉是否水解完全，水解完全后，滴入一滴酚酞试剂，用NaOH 溶液滴定至溶液微红将溶液容至100ml，即得到总糖样品待测溶液实验步骤1234567、8(还原还原糖）糖）9、10（总（总糖）糖）葡萄糖溶液或待测溶液（ml)00.20.40.60.81.02.00.5蒸馏水（ml)2.01.81.61.41.21.001.5DNS(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.5震荡摇匀溶液，沸水浴 5min,冷却后定容至 20ml，上下颠倒混匀，放置约 20min将上表中

13、各溶液用分光光度计测量吸光度，用16号试管数据绘制标准曲线，将7、8、9、10号试管所得吸光度和绘制的标准曲线比对，计算还原糖和总糖的平均含量。实验结果及分析实验结果及分析参考实例y=0.8116x-0.1074R2=0.999200.10.20.30.40.50.60.70.800.20.40.60.811.2系列1线性(系列1)还原糖：5.13%总糖：82.7%实验结果及分析思考问题提取还原糖步骤中为什么要离心？为什么总糖的计算公式中要乘以0.9？简述分光光度计的使用。注意事项 离心管盖子应盖紧，管中液体不超过4/5，离心管应对称摆放 操作过程中所有洗涤操作应多次少量 皮肤沾到HCL、NaOH、DNS等有毒或腐蚀性试剂应立即用大量水冲洗，注意实验安全生化一组祝大家实验成功Thank you!