第3章蛋白质的通性、纯化和表征详解课件.ppt

1、第第3 3章章 蛋白质的通性、纯化和表征蛋白质的通性、纯化和表征一、一、蛋白质的酸碱性质和等电点蛋白质的酸碱性质和等电点蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。等电点：蛋白质所带净电荷为零等电点：蛋白质所带净电荷为零的的pH值称为等电点。值称为等电点。在等电点在等电点时时，蛋白质，蛋白质在电场中不移动在电场中不移动,溶解度最小，粘度溶解度最小，粘度最大。可以用溶解度法，聚焦电泳法等测定等电点。最大。可以用溶解度法，聚焦电泳法等测定等电点。二、二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在蛋白质分子直径在1

2、-1001-100nmnm之间，在水溶液中具有之间，在水溶液中具有胶体溶液胶体溶液的通性。的通性。1 1、稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：蛋白质表面极性基团形成的蛋白质表面极性基团形成的水化膜水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀；不会互相碰撞凝聚而沉淀；两性电解质非等电状态时，带同种电荷，构成稳定的两性电解质非等电状态时，带同种电荷，构成稳定的双电双电层层，互相排斥不致聚集沉淀。，互相排斥不致聚集沉淀。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜半透膜，因此可以应，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。

3、用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。溶液中析出沉淀。2、沉淀蛋白质的方法沉淀蛋白质的方法盐析法盐析法:大量的中性盐（大量的中性盐（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl），），使蛋白质使蛋白质脱去脱去水化层水化层而聚集沉淀；不引起变性。而聚集沉淀；不引起变性。有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：破坏水化膜，降低介电常数，丙酮、乙醇等；破坏水化膜，降低介电常数，丙酮、乙醇等；重金属盐沉淀：重金属盐沉淀：pHpI时，蛋白质颗粒带负电荷，与重金属离子（时，蛋白质颗粒带负电荷，与重金属离子（

4、Hg2+.Pb2+.Cu2+等）结成不溶性沉淀；等）结成不溶性沉淀；生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于小于pI时，蛋白质带正电荷，易与生物时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸；钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸；加热变性沉淀法。加热变性沉淀法。三、蛋白质分离纯化的一般原则三、蛋白质分离纯化的一般原则纯化的实质：增加制品的纯度或比活性纯化的实质：增加制品的纯度或比活性一般程序：前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶保一般

5、程序：前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶保存存 电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析1、前处理（、前处理（pretreatment）：）：将组织和细胞破碎将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机动物组织和细胞：电动捣碎机 、匀浆器、超声波处理；匀浆器、超声波处理；植物组织和细胞：石英砂植物组织和细胞：石英砂+提取液研磨或用纤维素酶处理；提取液研磨或用纤维素酶

6、处理；细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）如果所要蛋白质集中在某一细胞组分，用差速离心法收集细胞的某一组如果所要蛋白质集中在某一细胞组分，用差速离心法收集细胞的某一组分（表分（表75）；）；如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。2、粗分级分离（、粗分级分离（rough fractionation)一般用选择性沉淀法。一般用选择性沉淀法。（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）分级沉淀法（盐析）等电点选择性沉淀法等电点选择性沉淀

7、法有机溶剂分级沉淀法有机溶剂分级沉淀法3、细分级分离（、细分级分离（fine fractionation)层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相和层析、疏水层析（反相HPLC）电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳等）、等电聚焦、双向电泳薄膜电泳等）、等电聚焦、双向电泳密度梯度离心密度梯度离心4、结晶（晶体保存）、结晶（晶体保存）结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度 的一个的一个

8、指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节调节pH。四、四、蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小的差异（一）根据分子大小的差异透析法：将样品装在透析法：将样品装在透析袋里，半透膜透析袋里，半透膜阻留阻留prpr分子，而让分子，而让小的溶质分子和水小的溶质分子和水通过，以达到除去通过，以达到除去蛋白质溶液中小分蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸子（盐、低分子

9、酸等）。等）。透析和超过滤法：都是利用蛋白质不能通过半透透析和超过滤法：都是利用蛋白质不能通过半透膜膜 的性质除去样品中的小分子非蛋白物质的性质除去样品中的小分子非蛋白物质超过滤法：施以一定的压力强迫超过滤法：施以一定的压力强迫小分子物质通过半透膜，而小分子物质通过半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子。应的蛋白质分子。凝胶过滤法（分子筛层析法）凝胶过滤法（分子筛层析法）凝胶过滤常用的介质凝胶过滤常用的介质：在层析柱内装填带有小孔的凝胶颗粒。在层析柱内装填带有小孔的凝胶颗粒。交联葡聚糖（交联葡聚糖（Sephadex，是由葡聚糖与环氧氯丙烷，是由葡聚糖与环氧氯丙

10、烷交联形成的有三维空间的网状结构物）。交联形成的有三维空间的网状结构物）。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶凝胶过滤的原理凝胶过滤的原理（二）根据溶解度差异的分离法（二）根据溶解度差异的分离法蛋白质的盐溶与盐析蛋白质的盐溶与盐析盐溶：是指在适当的盐溶：是指在适当的中性盐浓度溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象，中性盐浓度溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象，称盐溶。称盐溶。盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（高盐浓度）时，会破坏蛋白高盐浓度）时，会破坏蛋白质分子表面的水化层（即破坏了蛋白质在水溶液的稳定性因素）导质分子表面的水化层（即破坏了蛋白质在水溶

11、液的稳定性因素）导致蛋白质的溶解度降低发生沉淀析出，称盐析。致蛋白质的溶解度降低发生沉淀析出，称盐析。常用的饱和硫酸铵沉淀法分离纯化蛋白质就是利用盐析的原理，不同常用的饱和硫酸铵沉淀法分离纯化蛋白质就是利用盐析的原理，不同的蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，所以，可以通过饱和硫酸铵的的蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，所以，可以通过饱和硫酸铵的分级沉淀法分离各种蛋白质。分级沉淀法分离各种蛋白质。（三）（三）根据电荷性质的差异根据电荷性质的差异1、电泳法、电泳法电泳：带电荷的蛋白质或核酸分子在电场中移动的现象称为电泳。电泳：带电荷的蛋白质或核酸分子在电场中移动的现象称为电泳。带正电荷向负极泳动，而带负电

12、荷向正极泳动，分子量小的蛋白质带正电荷向负极泳动，而带负电荷向正极泳动，分子量小的蛋白质泳动快，分子量大的泳动慢，于是蛋白质被分离。泳动快，分子量大的泳动慢，于是蛋白质被分离。影响因素影响因素电荷、粒子的大小和溶液的粘度电荷、粒子的大小和溶液的粘度电场强度电场强度溶液的溶液的pH2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理基本原理：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，根据被分离物质所以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，根据被分离物质所带电荷的多少、分子形状、分子大小的不同，带电荷的多少、分子形状、分子大小的不同，在电场的作用下产生不同的移动速度而分离的在电场的作用下产生不同的移动速度而分离的方法。方法。聚丙烯

13、酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合而成。丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合而成。网状的大小决定于单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯网状的大小决定于单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。酰胺的浓度及两者的比例。SDS(sodium dodecyl sulfate)l若果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入若果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，SDS是一种阴离子表面活是一种阴离子表面活性剂，性剂，几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸展状态，

14、消除了蛋白质形状对迁移率的影响；解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质形状对迁移率的影响；lSDS能以能以1:2比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大量的净负电荷，多肽链上带的负电荷量远超过蛋白质分子原有的电量的净负电荷，多肽链上带的负电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的SDS蛋白质复合物，电泳时都以几乎同样的电荷质量比向正极移蛋白质复合物，电泳时都以几乎同样的电荷质量比向正极移动并具有相同的构象，所以同一电泳条件下，分子量成为决定蛋

15、白动并具有相同的构象，所以同一电泳条件下，分子量成为决定蛋白质泳动速率的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳动越慢。质泳动速率的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳动越慢。3.等电聚焦等电聚焦（1）基本原理）基本原理根据蛋白质分子的等电点进行分离。利用这种技术分离蛋白质混合物根据蛋白质分子的等电点进行分离。利用这种技术分离蛋白质混合物是在具有是在具有pH梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质将移向并聚集（停留）在等于其等电点的将移向并聚集（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个梯度处，并形成一个很窄的区带。很窄的区带。（2）优点及

16、主要用途）优点及主要用途加样位置和体积不受严格限制，分辨率很高，可测定加样位置和体积不受严格限制，分辨率很高，可测定pI，分离速度快，分离速度快，分离的蛋白质不变性。分离的蛋白质不变性。可用于蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质可用于蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质pI的测定。的测定。（3）基本操作）基本操作1、胶的制备、胶的制备(需两性电解质）需两性电解质）2、加样和电泳、加样和电泳 3、染色和脱色、染色和脱色（1 1）基本原理）基本原理 利用被分离物质的电荷与层析载利用被分离物质的电荷与层析载体电荷的相互作用达到分离纯化。体电荷的相互作用达到分离纯化。基质：纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖、

17、基质：纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖、层析载体由基质和带电基团组成层析载体由基质和带电基团组成4、离子交换层析法：、离子交换层析法：层析载体的种类：层析载体的种类：阳离子交换剂（带负电）阳离子交换剂（带负电）如：磺丙基（强酸型）如：磺丙基（强酸型）SP-Sephadex -O-(CH2)3-SO3H阴离子交换剂（带正电）阴离子交换剂（带正电）如：二乙基氨基乙基（中强碱型）如：二乙基氨基乙基（中强碱型）蛋白质与离子交换剂间的主要作用：静电引力蛋白质与离子交换剂间的主要作用：静电引力（2 2）基本操作）基本操作1 1、样品准备、样品准备2 2、离子交换剂和层析柱的制备、离子交换剂和层析柱的制备选择

18、合适的离子交换剂，进行预处理，柱床体积为样品体积选择合适的离子交换剂，进行预处理，柱床体积为样品体积的的2-52-5倍。倍。3 3、上样。、上样。4 4、目的蛋白的洗脱、目的蛋白的洗脱洗脱方式有逐步提高洗脱液的盐浓度（离子强度）和逐步提洗脱方式有逐步提高洗脱液的盐浓度（离子强度）和逐步提高洗脱液的高洗脱液的pHpH。5 5、洗脱液的鉴定和回收、洗脱液的鉴定和回收蛋白质成分常用蛋白质成分常用280nm280nm紫外吸收法监测紫外吸收法监测（四）（四）亲和层析亲和层析亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，建立起来的一种有效的纯化方法。识别能力

19、，建立起来的一种有效的纯化方法。配基：酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结配基：酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体等。构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体等。亲和层析的原理：亲和层析的原理：亲和层析的原理亲和层析的原理五、蛋白质相对分子质量的测定五、蛋白质相对分子质量的测定1、凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤所用介质为凝胶珠或称为凝胶颗粒，其内部为凝胶过滤所用介质为凝胶珠或称为凝胶颗粒，其内部为多孔网状结构多孔网状结构凝胶颗粒中具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子凝胶颗粒中具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入凝胶颗粒内部

20、，而大于胶粒微孔的分子则被排阻在外进入凝胶颗粒内部，而大于胶粒微孔的分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液先流下来，洗脱液体积小；小分洗脱时大分子随洗脱液先流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大脱体积大测定蛋白质分子量一般用交联葡聚糖作为凝胶，商品名：测定蛋白质分子量一般用交联葡聚糖作为凝胶，商品名：Sephadex测得几种标准蛋白质的洗脱体积测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve以相对分子质量对数（以相对分子质量对数（logM）对）对Ve作图，得标准曲线作图，得标准曲线再测出未知样品洗脱体积再测出未知样品

21、洗脱体积Ve从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量2.SDSPAGE（十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）用用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性（肽链伸展）并与蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成结合，形成SDS-蛋白质蛋白质 复合物复合物用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的相对迁用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的相对迁移率作图移率作图测出待测样品的相对迁移率测出待测样品的相对迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量从标准曲线上查出样品的相对分子质量影响迁

22、移率的主要因素影响迁移率的主要因素l凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会 产产 生不同生不同的阻力的阻力主要因素主要因素l凝胶的浓度和交联度凝胶的浓度和交联度l同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小相对分子质量大者，迁移率小 优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品 缺点：误差大，约为缺点：误差大，约为10（误差主要来源于迁移距离（误差主要来源于迁移距离的测量误差）的测量误差）此方法只能测得此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量

23、亚基肽链的相对分子质量六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定总蛋白含量分析：凯氏定氮法、总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚法（酚法（Lowry法）、法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（Bradford法）法）：考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250是一种带是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下可与有负电荷的染料，在酸性条件下可与Pr上的正电荷结合，上的正电荷结合，形成蓝色化物，在形成蓝色化物，在595nm具有特定吸收具有特定吸收。紫外吸收法：紫外吸收法：由于核酸在由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，

24、可采具有光吸收，对测定干扰较大，可采用用280nm、260nm同测法。同测法。蛋白质浓度蛋白质浓度mg/ml1.45A280-0.74A260（一）蛋白质含量测定特定蛋白组分的含量分析：特定蛋白组分的含量分析：酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）其它蛋白：抗原抗体反应其它蛋白：抗原抗体反应(western blot)（二）蛋白质纯度鉴定（均一性）（二）蛋白质纯度鉴定（均一性）基本手段：基本手段：电泳分析电泳分析:单条带单条带 沉降分析沉降分析:单一的沉降速度单一的沉降速度 溶解度分析溶解度分析:溶解度曲线只呈现一个折点溶解度曲线只呈现一个折点 N端测定：均一的单链蛋白质端测定：均一的单链蛋白质N端残基只端残基只可能有一种氨基酸。可能有一种氨基酸。*