乙肝病毒耐药变异的检测课件.ppt

1、乙肝病毒耐药变异的检测乙肝病毒耐药变异的检测 及临床意义及临床意义 主要内容主要内容乙肝病毒的活跃复制与乙肝肝硬化和肝乙肝病毒的活跃复制与乙肝肝硬化和肝癌密切相关；癌密切相关；抗病毒治疗是控制乙肝的有效治疗抗病毒治疗是控制乙肝的有效治疗核苷类药物的主要临床效果与耐药发生核苷类药物的主要临床效果与耐药发生病毒耐药的主要检测方法病毒耐药的主要检测方法病毒耐药的临床意义与防治对策病毒耐药的临床意义与防治对策(台湾队列研究:3851例HBsAg阳性者经13年隨访)Chen CJ.J Hepatol 2005,42:16(A35)11年前HBV DNA水平11年后肝硬化发生率36.2%106104-10

2、523.5%103-104300-1039.8%3005.9%4.5%1991-1992年台湾3582例没有治疗的HBV患者进行平均11年随访研究HBV DNA肝硬化 慢性乙肝的抗病毒治疗慢性乙肝的抗病毒治疗对于慢性乙肝，抗病毒治疗已成为对于慢性乙肝，抗病毒治疗已成为最主要和最有效的治疗；最主要和最有效的治疗；国内外的慢性乙肝防治指南均推荐国内外的慢性乙肝防治指南均推荐实行抗病毒治疗。实行抗病毒治疗。抗乙肝病毒治疗药物抗乙肝病毒治疗药物第一类：第一类：a干扰素：干扰素：包括普通干扰素和聚乙包括普通干扰素和聚乙 二醇干扰素。主要药理作用是直接二醇干扰素。主要药理作用是直接 抑制病毒复制和增强机体

3、免疫功能；抑制病毒复制和增强机体免疫功能；第二类：核苷第二类：核苷(酸酸)类药物：抑制病毒类药物：抑制病毒DNA聚聚 合酶和逆转录酶；合酶和逆转录酶；NAIFNLVDFTCLdTClevudineADVTDFETVL-核苷核苷无环磷酸盐化合物无环磷酸盐化合物环戊烷环戊烷/烯烯抗抗HBVHBV核苷类药物的分类核苷类药物的分类 核苷核苷(酸酸)类药物的分类类药物的分类 左旋核苷类：拉米夫定，替比夫定左旋核苷类：拉米夫定，替比夫定 环戊烷环戊烷(烯烯)类：恩替卡韦类：恩替卡韦 无环磷酸盐类无环磷酸盐类(核苷酸类核苷酸类)：阿德福韦：阿德福韦 替诺福韦替诺福韦一年抗病毒治疗一年抗病毒治疗HBV DNA

4、测不出比率测不出比率 HBeAg阳性病例 HBeAg阴性病例一年抗病毒治疗一年抗病毒治疗ALT复常率复常率 HBeAg阳性病例 HBeAg阴性病例一年抗病毒治疗一年抗病毒治疗HBeAg血清转换率血清转换率一年抗病毒治疗一年抗病毒治疗HBsAg血清转换率血清转换率5%10%3%0%0%0%0%0%pegIFNLVDADVL-dtETVTDV 乙肝病毒的耐药现象乙肝病毒的耐药现象病毒的基因突变导致耐药病毒的基因突变导致耐药耐药导致疗效降低或丧失耐药导致疗效降低或丧失病毒的自发突变导致耐药株出现病毒的自发突变导致耐药株出现病毒颗粒的高复制率：病毒颗粒的高复制率：1012-13个病毒颗粒个病毒颗粒/天

5、天自发突变的高发生率自发突变的高发生率 HBV 逆转录酶缺乏纠逆转录酶缺乏纠 错功能：错功能：10-5 置换置换/碱基碱基/循环循环每天每个碱基位置上都可能发生突变每天每个碱基位置上都可能发生突变治疗前耐药突变株可能已存在治疗前耐药突变株可能已存在适者生存适者生存:在抗病毒治疗过程中，对药物不敏在抗病毒治疗过程中，对药物不敏感而具有生存优势的变异株成为成为优势株感而具有生存优势的变异株成为成为优势株抗病毒治疗 SSS SS S SRRR RRRRSS核苷类药物的耐药机制核苷类药物的耐药机制病毒每日每时都在发生各种突变，包括病毒每日每时都在发生各种突变，包括对核苷类药物的耐药突变；但一般而言，对

6、核苷类药物的耐药突变；但一般而言，突变株病毒复制能力弱于野生株，因此突变株病毒复制能力弱于野生株，因此未用过核苷类药物的病人总是野生株占未用过核苷类药物的病人总是野生株占优势。优势。在应用核苷类药物后，敏感的野生株受到在应用核苷类药物后，敏感的野生株受到药物的强烈抑制，逐渐减少消失，而自发药物的强烈抑制，逐渐减少消失，而自发出现的耐药变异株不受药物抑制，逐渐增出现的耐药变异株不受药物抑制，逐渐增多成为优势株。多成为优势株。因此核苷类药物对耐药株病毒起到了选择因此核苷类药物对耐药株病毒起到了选择作用，而不是诱导突变的作用。作用，而不是诱导突变的作用。核苷类药物的耐药机制核苷类药物的耐药机制 St

7、ephen L Locarnini等分析：等分析：HIV的抗病毒治疗也会导致病毒耐药，这是人的抗病毒治疗也会导致病毒耐药，这是人 们早就熟知的问题。但相比较而言，们早就熟知的问题。但相比较而言，HBV发发 生耐药变异的速度要慢很多。拉米夫定治疗乙生耐药变异的速度要慢很多。拉米夫定治疗乙 肝一年的耐药率约肝一年的耐药率约20，而拉米夫定治疗，而拉米夫定治疗HIV 时，最快时，最快1周就可能发生耐药突变；周就可能发生耐药突变；Joseph J Sasadeusz,Stephen L Locarnini,Graeme Macdonald MJA 2007,186:204核苷类药物治疗核苷初治患者耐药

8、发生率核苷类药物治疗核苷初治患者耐药发生率 基因型耐药或耐药导致的病毒学反弹*拉米夫定,阿德福韦,恩替卡韦为基因型耐药发生率,替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率1.2核苷核苷(酸酸)类药物治疗后类药物治疗后 病毒耐药的检测病毒耐药的检测检测病毒耐药变异的最常用的方法有：检测病毒耐药变异的最常用的方法有：直接测序法直接测序法 限制性片段长度多态性分析法限制性片段长度多态性分析法 线性探针反向杂交法线性探针反向杂交法1.基因芯片法基因芯片法DNA序列分析法序列分析法 对病毒全基因或对病毒全基因或P基因进行基因进行PCR扩增扩增 将将PCR产物制备克隆产物制备克隆 挑选一定数量的克隆测序挑选一定

9、数量的克隆测序扩增目的基因扩增目的基因PCR产物产物变异株野生株PCR产物克隆产物克隆PCR产物克隆序列分析产物克隆序列分析（每例标本（每例标本20-25个克隆）个克隆）直接序列分析的优缺点直接序列分析的优缺点 可以发现新的变异位点，包括已上市药物的可以发现新的变异位点，包括已上市药物的 新的变异位点和新药的变异位点；新的变异位点和新药的变异位点；2.灵敏度低，只有当变异株数量超过灵敏度低，只有当变异株数量超过DNA总量总量 的的20%时才能测出；时才能测出；3.选取克隆数量少时容易出现误差；选取克隆数量少时容易出现误差；限制性片段长度多态性分析法限制性片段长度多态性分析法Restrictio

10、n Fragment Length Polymorphism 提取总提取总HBV DNA，扩增，扩增P基因突变区的基因突变区的DNA序列；序列；用错配引物对上述用错配引物对上述PCR产物进行第二次扩增，目的产物进行第二次扩增，目的 是引入酶切位点；是引入酶切位点；3.用限制性内切酶进行酶切分析：野生株和变异株因用限制性内切酶进行酶切分析：野生株和变异株因 引入酶切位点的不同，在酶切后表现为不同的分子引入酶切位点的不同，在酶切后表现为不同的分子 长度片段，电泳时出现不同的条带，以此诊断野生长度片段，电泳时出现不同的条带，以此诊断野生 株或是变异株；株或是变异株；野生株序列：野生株序列：T A T

11、 A T G 736 737 738 739 740 741 T A T G T G 736 737 738 739 740 741YVDD变异序列：变异序列：T A T A T T 736 737 738 739 740 741YIDD变异序列：变异序列：NdeI酶切位点：酶切位点：C A T A T G 736 737 738 739 740 741孙剑孙剑 等等 第一军医大学学报第一军医大学学报 1999，6:489-492引入酶切引物后的序列：引入酶切引物后的序列：C A T A T G 736 737 738 739 740 741野生株野生株NdeINdeI C A T G T G

12、 736 737 738 739 740 741YVDD变异株变异株NdeINdeIYIDD变异株变异株 C A T A T T 736 737 738 739 740 741NdeINdeI短片段短片段长片段长片段长片段长片段孙剑孙剑 等等 第一军医大学学报第一军医大学学报 1999，6:489-492 分子量标记分子量标记 2.野生株阳性对照野生株阳性对照3.野生株野生株 4.混合变异混合变异5.变异株变异株 6.变异株变异株 孙剑孙剑 等等 第一军医大学学报第一军医大学学报 1999，6:489-49211589RFLP方法的优缺点方法的优缺点 灵敏度高，能检出低至灵敏度高，能检出低至5

13、%的变异株；的变异株；方法简便易行；方法简便易行；只能检出已知位点，不能发现新位点；只能检出已知位点，不能发现新位点；并非所有的变异位点都能使用并非所有的变异位点都能使用RFLP法，法，因为有些变异不存在特异性的酶切位点；因为有些变异不存在特异性的酶切位点；5.有些突变破坏了限制性内切酶位点，导有些突变破坏了限制性内切酶位点，导 致内切酶失败致内切酶失败 6.酶反应条件的限制导致有些突变不能酶切。酶反应条件的限制导致有些突变不能酶切。线性探针反向杂交法线性探针反向杂交法(INNO-LIPA HBV DR v1.2.3)将反向杂交探针包被于检测条上；将反向杂交探针包被于检测条上；扩增标本扩增标本

14、HBV DNA-P区区(A-F)；将将PCR产物与检测条上的探针杂交；产物与检测条上的探针杂交；显色，阅读结果。显色，阅读结果。INNO-LIPA HBV DR 第一代产品：检测第一代产品：检测LAM变异的变异的180和和204位点；位点；第二代产品：第二代产品：180+204+80+173（LAM）181+236（ADV）第三代产品：两个检测条，第一条是第三代产品：两个检测条，第一条是v.2，第二，第二 个条是检测个条是检测ETV变异和变异和TDV变异，变异，并加入了并加入了ADV原发无应答的变异；原发无应答的变异；针对不同的药物，针对不同的药物，不同的变异位点，不同的变异位点，不同的变异方

15、式，不同的变异方式，不同的基因型。不同的基因型。共包被有共包被有54条探针，条探针，检出检出11个位点变异个位点变异123，4567891011线性探针反向杂交法优缺点线性探针反向杂交法优缺点 灵敏度高，可检出灵敏度高，可检出5%的变异株；的变异株；商品化试剂，操作方便快捷，结果稳定准确；商品化试剂，操作方便快捷，结果稳定准确；只能检出已知位点；只能检出已知位点；发现新位点后必须增加新探针；发现新位点后必须增加新探针；因为病毒有多种基因型，一个位点的突变，因为病毒有多种基因型，一个位点的突变，可能需要多个探针。最终为了检出所有突可能需要多个探针。最终为了检出所有突 变，需要大量不同的探针；变，

16、需要大量不同的探针；6.商品试剂盒价格昂贵。商品试剂盒价格昂贵。基因芯片法基因芯片法同线性探针反向杂交方法类似。同线性探针反向杂交方法类似。基因芯片又称基因微矩阵基因芯片又称基因微矩阵(microarray)，它，它是将大量特定的基因片段是将大量特定的基因片段(寡核苷酸片段寡核苷酸片段)作为作为探针有序地、高密度地排列在固定载体上，然探针有序地、高密度地排列在固定载体上，然后与待测标本进行杂交，最后显色，阅读结果。后与待测标本进行杂交，最后显色，阅读结果。基因芯片检测模式基因芯片检测模式单万水 等 全国第2届中西医结合传染病学术会议论文汇编，2008 病毒耐药变异检测的临床意义病毒耐药变异检测

17、的临床意义 治疗开始前的耐药病毒检测可以帮助治疗开始前的耐药病毒检测可以帮助 选择初治药物；选择初治药物；2.治疗后的耐药监测有助于及时采取挽治疗后的耐药监测有助于及时采取挽 救治疗措施；救治疗措施；3.根据耐药变异位点的不同选择合适的根据耐药变异位点的不同选择合适的 药物；药物；乙肝病毒耐药位点乙肝病毒耐药位点拉米夫定：拉米夫定：L80I V173L L180M M204I M204V恩替卡韦：恩替卡韦：V173L L180M A184G S202I M204I M204V M250V替比夫定替比夫定 M204I阿德福韦：阿德福韦：A181V N236T替诺福韦：替诺福韦：A194TFTC：

18、M204I M204V u阿德福韦原发耐药：阿德福韦原发耐药：I233V与耐药相关的病毒变异与耐药相关的病毒变异LAMETVLdTFTCADVTDV L80I V173L L180M A181V A184G A194T S202I M204I M204V N236T M250VI233VI233V:ADV原发无应答原发无应答注：注：核苷(酸)类药物耐药后挽救治疗方案药物耐药药物耐药挽救治疗方案挽救治疗方案拉米夫定耐药拉米夫定耐药加阿德福韦加阿德福韦换恩替卡韦换恩替卡韦(有恩替卡韦耐药风险有恩替卡韦耐药风险)加替诺福韦或换加替诺福韦或换Truvada(TDF+FTC)阿德福韦耐药阿德福韦耐药加拉

19、米夫定加拉米夫定换换/加用恩替卡韦加用恩替卡韦 (如果事先没有拉米夫定耐药如果事先没有拉米夫定耐药)换用换用Truvada 替比夫定耐药替比夫定耐药加阿德福韦或者替诺福韦加阿德福韦或者替诺福韦换用恩替卡韦换用恩替卡韦(有恩替卡韦耐药风险有恩替卡韦耐药风险)加替诺福韦或换加替诺福韦或换Truvada恩替卡韦耐药恩替卡韦耐药加加/换用阿德福韦或替诺福韦换用阿德福韦或替诺福韦换用换用 TruvadaLok ASF&McMahon BJ.AASLD Practice Guideline 2009 Hepatology 2009拉米夫定耐药的处理拉米夫定耐药的处理优先选择：优先选择：拉米夫定拉米夫定+阿

20、德福韦酯联合治疗阿德福韦酯联合治疗次选次选 1.：恩替卡韦恩替卡韦1mg(倍量倍量)次选次选 2.：替诺福韦替诺福韦300mg次选次选 3.：替比夫定替比夫定+阿德福韦酯联合治疗阿德福韦酯联合治疗次选次选 4.：恩替卡韦恩替卡韦0.5mg+阿德福韦酯阿德福韦酯次选次选 5.：替比夫定（经耐药位点测定为替比夫定（经耐药位点测定为YVDD变异）变异）不宜选择：不宜选择：单用阿德福韦酯单用阿德福韦酯不宜选择：不宜选择：恩替卡韦恩替卡韦0.5mg 或或 替比夫定替比夫定 替比夫定耐药的处理替比夫定耐药的处理优先选择：优先选择：替比夫定替比夫定+阿德福韦酯联合治疗阿德福韦酯联合治疗次选次选 1.：恩替卡

21、韦恩替卡韦1mg(倍量倍量)次选次选 2 ：替诺福韦替诺福韦300mg次选次选 3.：恩替卡韦恩替卡韦0.5mg+阿德福韦酯阿德福韦酯不宜选择：不宜选择：单用阿德福韦酯单用阿德福韦酯不宜选择：不宜选择：恩替卡韦恩替卡韦0.5mg 或或 拉米夫定拉米夫定 阿德福韦酯耐药的处理阿德福韦酯耐药的处理优先选择：优先选择：恩替卡韦或替比夫定恩替卡韦或替比夫定次选次选 1.：阿德福韦酯阿德福韦酯+拉米夫定拉米夫定次选次选 2 ：拉米夫定拉米夫定次选次选 3.：恩替卡韦恩替卡韦0.5mg+阿德福韦酯阿德福韦酯 恩替卡韦耐药处理恩替卡韦耐药处理优先选择：恩替卡韦优先选择：恩替卡韦0.5mg+阿德福韦酯阿德福韦酯次选次选 ：替诺福韦：替诺福韦300mg不宜选择：不宜选择：换用阿德福韦酯，或拉米夫定，换用阿德福韦酯，或拉米夫定，或替比夫定或替比夫定不宜选择：不宜选择：恩替卡韦恩替卡韦1.0mg