专题基因工程的基本操作程序课件.ppt
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- 专题 基因工程 基本 操作 程序 课件
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1、理解教材新知理解教材新知专专题题1 11.21.2把握热点考向把握热点考向应用创新演练应用创新演练知识点一知识点一知识点三知识点三考向一考向一考向二考向二考向三考向三知识点二知识点二 1获取目的基因的常用方法有:从基因文库获取目的基因的常用方法有:从基因文库 中获取目的基因和利用中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基技术扩增目的基 因。因。2基因表达载体的构建是实施基因工程的基因表达载体的构建是实施基因工程的 第二步,也是基因工程的核心。第二步,也是基因工程的核心。3一个基因表达载体的组成,除了目的基因一个基因表达载体的组成,除了目的基因 外,还必须有启动子、终止子以及标记基因。外,还必须有
2、启动子、终止子以及标记基因。4将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花 粉管通道法。粉管通道法。5培育转基因动物时,受体细胞一般是受精卵,目的基因的导入方培育转基因动物时,受体细胞一般是受精卵,目的基因的导入方 法常用显微注射技术。法常用显微注射技术。6检测目的基因是否导入和转录,常用分子杂交技术;检测是否翻检测目的基因是否导入和转录,常用分子杂交技术;检测是否翻 译,常用抗原译,常用抗原抗体杂交技术。抗体杂交技术。自读教材自读教材夯基础夯基础 1目的基因目的基因 (1)主要是指主要是指 的基因。的基因。(2)也可以是一些
3、具有也可以是一些具有 的因子。的因子。2获取方法获取方法 (1)从基因文库中获取:从基因文库中获取:基因文库的含义:将含有某种生物不同基因的许基因文库的含义:将含有某种生物不同基因的许多多 ,导入,导入 的群体中储存,各个受体菌分别含的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。有这种生物的不同的基因。编码蛋白质编码蛋白质调控作用调控作用DNA片段片段受体菌受体菌(2)利用利用PCR技术扩增目的基因:技术扩增目的基因:原理:原理:。前提条件:有一段已知目的基因的前提条件:有一段已知目的基因的 ,以便根据,以便根据这一序列合成这一序列合成 。条件:条件:DNA模板、模板、和和4种脱氧核种
4、脱氧核苷酸。苷酸。DNA复制复制核苷酸序列核苷酸序列引物引物热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶引物引物返回学车问答 http:/ 学车问题回答驾驶员模拟考试2016 http:/ 科目一 科目二 科目三 科目四扩增过程:扩增过程:受热受热引物引物热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶(3)1探讨基因文库、基因组文库、探讨基因文库、基因组文库、cDNA文库之间的关系。文库之间的关系。提示:提示:基因组文库含有一种生物的全部基因,而基因组文库含有一种生物的全部基因,而cDNA文文库只含有一种生物的部分基因,二者都是基因文库。库只含有一种生物的部分基因,二者都是基因文库。2从酶的角度分析从酶的角度分析PCR技术
5、扩增技术扩增DNA与与DNA体内复制的体内复制的不同点。不同点。提示:提示:PCR技术扩增技术扩增DNA不需要解旋酶;不需要解旋酶;PCR技术需技术需要的要的DNA聚合酶应具有热稳定性。聚合酶应具有热稳定性。跟随名师跟随名师解疑难解疑难1提取目的基因方法的比较提取目的基因方法的比较方方法法基因文库的构建基因文库的构建PCR技术技术扩增扩增人工合成人工合成基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库(如如cDNA文库文库)过过程程供体细胞中的供体细胞中的DNA 限制酶限制酶许多许多DNA片段片段 连接连接表达载体表达载体 导入导入受体细胞受体细胞 外源外源DNA扩增,产生扩增,产生特定性状特定性
6、状 分离分离目的基因目的基因目的基因的目的基因的mRNA 反转录反转录单链单链DNA 合成合成双链双链DNA 插入插入载体载体 导入导入受体菌群受体菌群(cDNA文库文库)分离分离目的基因目的基因目的基因目的基因DNA 高温高温 解链解链单链单链DNA 与引与引 物结合物结合 、DNADNA 聚合聚合 酶酶大量目大量目的基因的基因蛋白质的氨蛋白质的氨基酸序列基酸序列 推测推测mRNA的核的核苷酸序列苷酸序列 推测推测基因的核基因的核苷酸序列苷酸序列 化学化学 合成合成目的基因目的基因方方法法基因文库的构建基因文库的构建PCR技术技术扩增扩增人工合成人工合成基因组文库基因组文库部分基因文部分基因
7、文库库(如如cDNA文库文库)优优点点操作简单操作简单专一性强专一性强可在短时可在短时间内大量间内大量扩增目的扩增目的基因基因专一性强,专一性强,可产生自然可产生自然界中不存在界中不存在的新基因的新基因缺缺点点工作量大、工作量大、盲目性大、盲目性大、专一性差专一性差操作过程较麻操作过程较麻烦,技术要求烦,技术要求过高过高需要严格需要严格控制温度、控制温度、技术要求技术要求高高适用范围小适用范围小2PCR技术与生物体内技术与生物体内DNA复制的比较复制的比较DNA复制复制PCR技术技术区区别别解旋解旋方式方式解旋酶催化解旋酶催化DNA在高温作用下变性解旋在高温作用下变性解旋场所场所细胞内细胞内(
8、主要在细胞核内主要在细胞核内)细胞外细胞外(主要在主要在PCR扩增仪内扩增仪内)酶酶DNA解旋酶、普通的解旋酶、普通的DNA聚合聚合酶等酶等耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶(Taq聚合酶聚合酶)温度温度条件条件细胞内温和条件细胞内温和条件需控制温度,在较高温度下进行需控制温度,在较高温度下进行合成合成的对的对象象DNA分子分子DNA片段或基因片段或基因联系联系模板:均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成模板:均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成原料:均为四种脱氧核苷酸原料:均为四种脱氧核苷酸酶:均需要酶:均需要DNA聚合酶进行催化聚合酶进行催化引物:均需要引物,使引物:均需要引物,使DNA聚合
9、酶从引物的聚合酶从引物的3端开始连接脱氧端开始连接脱氧核苷酸核苷酸 特别提醒特别提醒 (1)基因工程操作中,只有使用受体生物自身基因的启基因工程操作中,只有使用受体生物自身基因的启动子才比较有利于基因的表达。动子才比较有利于基因的表达。(2)通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子,只将文库获得的目的基因没有启动子,只将编码序列导入受体细胞中无法转录。编码序列导入受体细胞中无法转录。(3)热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶(Taq聚合酶聚合酶)能在高温下保持其能在高温下保持其活性,是活性,是PCR技术关键的工具之一。技术关键的工具之一。自读教材自读教材夯基础夯基础 1基因表达载体的构建基因表达
10、载体的构建 (1)目的:使目的基因在受体细胞中目的:使目的基因在受体细胞中 ,并且可以,并且可以遗传和遗传和 。(2)组成:组成:稳定存在稳定存在表达表达 2将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 (1)导入植物细胞的方法:导入植物细胞的方法:TDNA双子叶植物双子叶植物裸子裸子 :常用于单子叶植物。:常用于单子叶植物。花粉管通道法:目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。花粉管通道法:目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。(2)导入动物细胞:导入动物细胞:方法:方法:技术。技术。常用受体细胞:常用受体细胞:。植物植物基因枪法基因枪法显微注射显微注射受精卵受精卵 (3)导入微生物细胞:导入微生
11、物细胞:原核生物特点:原核生物特点:、多为、多为 、遗传物质、遗传物质相对相对 等。等。方法:感受态细胞法,即用方法:感受态细胞法,即用 处理细胞,使细处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态分子的生理状态(这种细这种细胞称为胞称为 )。繁殖快繁殖快单细胞单细胞Ca2较少较少感受态细胞感受态细胞 1思考基因表达载体的构建需要哪些工具酶。思考基因表达载体的构建需要哪些工具酶。提示:提示:限制酶、限制酶、DNA连接酶。连接酶。2结合教材结合教材P13资料卡分析,用花粉管通道法导入受体细资料卡分析,用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合?
12、试分析原因。胞的目的基因是否需要和载体结合?试分析原因。提示:提示:需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。3为什么动物的体细胞不能作为受体细胞?为什么动物的体细胞不能作为受体细胞?提示:提示:动物体细胞全能性受到限制,不能发育为一个新个动物体细胞全能性受到限制,不能发育为一个新个体。体。跟随名师跟随名师解疑难解疑难 1基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程 将切下的目的基因片段插入质粒的切口处,再加入适量将切下的目的基因片段插入质粒的切口处,再加入适量DNA连接酶,形
13、成一个重组连接酶,形成一个重组DNA分子分子(重组质粒重组质粒)。构建过程如。构建过程如图所示:图所示:2将目的基因导入受体细胞的方法比较将目的基因导入受体细胞的方法比较受体受体细胞细胞植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用常用方法方法农杆菌转化法、基因枪农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法法、花粉管通道法显微注射技术显微注射技术感受态细胞法感受态细胞法受体受体细胞细胞体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞转化转化过程过程以农杆菌转化法为例:以农杆菌转化法为例:将目的基因插入将目的基因插入Ti质粒质粒的的TDNA上上转入农杆菌中转入农杆菌中导入植物细胞导入植物细胞整合到受体
14、细胞的整合到受体细胞的DNA上上提纯含目的基提纯含目的基因的表达载体因的表达载体显微注射显微注射受精卵发育受精卵发育具有新性具有新性状的个体状的个体Ca2处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞基因表达载体与基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞混合感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNA分子分子 特别提醒特别提醒 (1)完成基因表达载体的构建,需要限制性核酸内切酶和完成基因表达载体的构建,需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶,连接产物有目的基因连接酶,连接产物有目的基因目的基因,目的基因目的基因,目的基因运运载体和运载体载体和运载体运载体三种。运载体三种。(2)将基因表达载体将基因表达载体(重组质粒重组
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