最新优质课件第八章-非水相酶催化.ppt

1、第八章 非水相酶催化主讲讲:李明顺顺生命科学学技术学术学院农业农业微生物国国家重点实验实验室87287701-8008(O)1非水酶学概述非水酶学概述有机介质中的酶促反应有机介质中的酶促反应23有机介质中酶的催化特性有机介质中酶的催化特性第六章：主要讲讲授内内容4气相和超临界介质的酶促反应气相和超临界介质的酶促反应水相中的酶催化反应水相中的酶催化反应非水相中的酶催化反应非水相中的酶催化反应有机介质的酶催化有机介质的酶催化气相介质的酶催化气相介质的酶催化离子液介质的酶催化离子液介质的酶催化超临界流体介质的酶催化超临界流体介质的酶催化酶催化反应酶催化反应水介质的酶催化水介质的酶催化常规反应体系常规

2、反应体系第一节：非水酶学概述水相中的酶催化反应水相中的酶催化反应(1)最常用，不适合有机化合物底物的反应应。(2)水解酶的水解反应应中，水浓浓度过过高，影响响反应应速度。定义义:酶在非水相介质质中进进行的催化作用优优点:(1)提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓浓度底物连续连续生物转转化。(2)改变变反应应平衡，水解酶能催化合成反应应，如脂的合成和肽肽的合成。(3)可以控制由水引起的副反应应(如酸酐酐的水解)。(4)酶不溶于有机介质质，易于回收再利用。(5)酶的固定化简单简单，可以只沉积积在载载体表面。(6)从从低沸点的溶剂剂中分离纯纯化产产物比水中容易。(7)酶的热稳热稳定性比水高，而且没没有

3、微生物污污染。用途:肽肽,酯类酯类等的生产产,第二节：有机介质中的酶促反应酶在含有一定量水的有机溶剂剂中进进行催化反应应的体系。(1)与与水互溶的有机溶剂剂-水单单相体系(亲亲脂性底物）由水和极极性较较大的有机溶剂剂相互混合组组成的反应应体系。辣根过氧过氧化物酶（HRP）催化酚类酚类或芳香胺类胺类底物聚合成聚酚酚或聚胺类胺类物质质，用于环环保黏合剂剂、导电导电聚合物和发发光聚合物等功能材料的研研究。一一.有机介质反应体系有机介质反应体系（2）与与水不溶性有机溶剂组剂组成的两两相或多相不均一体系由水和疏水性较较强的有机溶剂组剂组成的两两相或多相反应应体系。游离酶、亲亲水性底物或产产物溶解于水相，

4、疏水性底物或产产物溶解于有机溶剂剂相。催化反应应通常在两两相的界面上进进行（水与烷羟与烷羟，醚醚，氯氯代烷羟烷羟）。(3)非极极性有机溶剂剂-酶悬悬浮体系 由非极极性有机溶剂剂和微量的水组组成的反应应体系。主要是酶分子的结结合水，对维对维持酶分子的空间间构构象和催化活性至关关重要。(4)非极极性有机溶剂剂-PEG修饰饰酶单单相体系 用PEG修饰饰酶分子的赖氨赖氨酸，增加疏水性，增加有机溶剂剂中的溶解性，同时时具有亲亲水的微环环境。酶的稳稳定性大幅提高。（5)反胶胶束体系 在大量与与水不相混溶的有机溶剂剂中，含有少量水溶液。加入表面活性剂剂后形成的油包水的微小颗颗粒（极极性的一端朝内内，非极极性

5、的一端朝外）。水有机溶剂酶底物（6）（正）胶胶束体系 大量水溶液中含有少量与与水不相混溶的有机溶剂剂，加入表面活性剂剂后形成的水包油的微小颗颗粒（非极极性的一端朝内内，极极性的一端朝外）。水有机溶剂酶底物把有机溶剂中酶催化反应理解为宏观上是非水相，把有机溶剂中酶催化反应理解为宏观上是非水相，而微观上是微水相反应。因此非水体系又称低水而微观上是微水相反应。因此非水体系又称低水体系。体系。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一，对酶催化有影响。缺少的成分之一，对酶催化有影响。二二.有机介质中酶促反应的影响因素有机介质中酶促反应的影响因素

6、水的影响响 有机溶剂剂 pH 固定化 酶的形态态 温温度 添加物（一）水对有机介质中酶促反应的影响（一）水对有机介质中酶促反应的影响（1）对对酶分子空间构间构象的影响响（2）对对酶催化反应应速度的影响响（3）水活度（1）对对酶分子空间构间构象的影响响必需水(Essential Water)：维维持酶催化活性所必须须的最少量的水。与与酶分子紧紧密结结合的一层层左右的水分子，对对酶活性至关关重要的。不同酶与与必需水结结合的紧紧密程度及所结结合的必需水量是不同的。含水量与与酶稳稳定性有关关，温温度升高导导致酶分子发发生可逆折叠叠，然后进进行一种种或几种种下列反应应：(1)形成不规则结构规则结构。(2

7、)通过过消除使SS键键破坏。（-消除是指氨氨基酸残残基中碳碳原子上基团团的消除）。(3)Asn（天冬酰酰酸）和Gln（谷氨酰胺氨酰胺）脱酰脱酰胺胺。(4)Asn残残基水解。酶在无水环环境中不发发生上述反应应，表现异现异常稳稳定。必需水量对对酶活性的影响响 1983年，Rupley等人从从溶菌酶的结论结论得知，一个个干燥蛋白的水合(Hydration)过过程经过经过4个个步骤骤：(1)加入的水首先与与酶分子表面的带电带电基团结团结合，达达到每克蛋白质质00.07g水。(2)然后与与酶分子表面的极极性基团结团结合(每克蛋白质质0.070.25g水)。(3)多出来来的水再凝聚到蛋白质质分子表而相互作

8、用较较弱的部位(每克蛋白质质0.250.38g水)。(4)最后，酶分子表面完全水化，被一层层水分子所覆盖(每克蛋白质质0.38g水，大约约300个个水分子)。仿水溶剂剂绝对绝对无水条条件：酶分子表面的大量带电带电基团团和极极性基团团相互作用形成僵硬的失活构构想。适当当的水条条件：形成氢键氢键，柔性增大，维维持活性仿水溶剂剂替代水可控制和消除有水引起的逆反应应和副反应应。概概念：可用二甲基甲酰胺酰胺（DMF),乙二醇，丙酰胺酰胺等极极性添加剂剂部分或全部代替系统统中辅辅助溶剂剂水，从从而改变变酶的活性或立体选择选择性。（2）水对对酶催化反应应速度的影响响在催化反应应速度达达到最大时时的水含量为为

9、最适水含量。与与有机溶剂剂的种类种类，酶的纯纯度，固定化酶的载载体性质质和修饰剂饰剂有关关。例：马马肝醇脱氢脱氢酶在水含量较较低的条条件下，酶 的催化反应应速度随随水的含量的增加而升高。(3)水活度(Thermodynamic Water Activity，Aw)：（确定酶结结合水的多少的一个参数个参数）在一定温温度压压力下，反应应体系中的蒸汽压压和同样条样条件下纯纯水体系的蒸汽压压之比。Halling(1989)Aw=P/P0式中：P在一定条条件下体系中水的蒸气压气压 P0在相同条条件下纯纯水的蒸气压气压理由：(1)水活度的大小直接反映出酶分子上水分的多少，而与与体系中的含水量及所用的溶剂剂

10、无关关。(2)低水溶剂剂体系是一个个涉及到固体(酶及其载载体)、液体(含有底物的溶剂剂)和气气体(液面上部空间间)的多相体系，当当体系处处于平衡状态时状态时各相的水活度相等。(3)水活度的大小易测测，可以通过测过测定反应应物平衡的液面上气气体的相对湿对湿度来来得到。研研究表明，在一般条条件下，最适水含量随随着溶剂剂极极性的增加而增加，而最佳水活度与与溶剂剂的极极性大小没没有关关系，用水活度作为参数来研为参数来研究水对对酶催化作用的影响响更为为准确。Aw1：水解脂肪酶活性与与水的关关系在反应应体系中，必需水量也决决定于有机溶剂剂。加水量加水量%(V/V)%(V/V)相对活力相对活力%0 07 7

11、0.20.292920.40.41001002.02.07575（4 4）水对酶催化反应平衡及立体选择性的影响：）水对酶催化反应平衡及立体选择性的影响：利用水活度控制反应的平衡。利用水活度控制反应的平衡。Aw1：水解（二）有机溶剂的选择（二）有机溶剂的选择（1）有机溶剂对剂对酶结构与结构与功能的影响响A)对对酶分子表面结构结构的影响响 酶在有机介质质中与与有机溶剂剂接触触，酶分子的表面结构结构有所变变化。例：枯草杆菌蛋白酶晶体，原来来有119个与个与酶结结合的水分子，悬悬浮在乙腈腈中后与与酶分子结结合的水分子只有99个个，有12个个乙腈腈分子结结合到酶分子中，其中4个个是原来来水分子结结合的位

12、点。B)有机溶剂对剂对酶活性中心结结合位点的影响响 当当酶悬悬浮于有机溶剂剂中，有一部分溶剂剂能渗入到酶分子的活性中心，与与底物竞争竞争活性位点，降低底物结结合能力，从从而影响响酶的催化活性。例：辣根过氧过氧化物酶（HRP)在甲醇中催化时时，甲醇分子可以进进入活性中心，与卟啉铁与卟啉铁配位结结合。(2)有机溶剂对剂对酶活性的影响响 有些有机溶剂剂，特别别是极极性较较强的有机溶剂剂，如甲醇，乙醇等，会夺会夺取酶分子的结结合水，影响响酶分子微环环境的水化层层，从从而降低酶的催化活性，甚至引起酶失活。lgP-极极性系数数 P是指溶剂剂在正辛烷与烷与水两两相中的分配系数数，其对数对数lgP为极为极性系

13、数数表示溶剂极剂极性的强弱，系数数越大，极极性越小;系数数越小，极极性越大。lgP4的非极极性溶剂剂，酶有较较高的催化活力例：正己烷烷能够夺够夺取酶分子0.5%的结结合水，甲醇可以夺夺取酶分子60%的结结合水。lgP2的极极性溶剂剂一般不适宜作为为有机介质质酶催化反应应的溶剂剂使用。(3)有机溶剂对剂对底物和产产物分配的影响响 在有机溶剂剂中，酶能够够保持其“必需水”层层、形成柔韧韧性的天然构构象是酶发挥发挥活力的重要前提。有机溶剂剂能改变变酶分子必需水层层中底物和产产物的浓浓度。酶的活性中心底物必需水层有机溶剂产物lgP很大，疏水性太强，疏水性底物难难于从从有机溶剂剂中进进入必需水层层，而降

14、低酶的催化速度lgP很小，亲亲水性太强，疏水性底物在有机溶剂剂中的溶解度低，底物浓浓度降低，也使催化速度减减慢。一般选选用2lgP5的有机溶剂为剂为宜。（4）选择选择有机溶剂剂：有机溶剂与剂与底物和产产物的相容性。选择选择的溶剂对剂对主反应应惰性。其他因素：密度，粘度，表面张张力，废废物处处理，生产产成本等。第三节：有机介质中酶的催化特性酶活性的变变化稳稳定性的变变化pH 记忆记忆和分子印记记酶的底物专专一性的改变变反应应平衡方向的移动动酶促动动力学变学变化第三节：有机介质中酶的催化特性（1）相对专对专一性（2）立体异构选择异构选择性（3）区区域选择选择性（4）前手性选择选择性（一）酶的底物专

15、一性的改变（一）酶的底物专一性的改变第三节：有机介质中酶的催化特性 在极极性较较强的有机溶剂剂中，疏水性较较强的底物容易反应应；在极极性较较弱的有机溶剂剂中，疏水性较较弱的底物容易反应应。例：枯草杆菌蛋白酶催化N乙酰酰L-丝氨丝氨酸乙酯酯和N乙酰酰L-苯苯丙氨氨酸乙酯与酯与丙醇的转酯转酯反应应，在极极性较较弱的二氯氯甲烷烷或在苯苯介质质中，含丝丝氨氨酸的底物优优先反应应；在极极性较较强的吡啶吡啶或季丁醇介质质中，则则含苯苯丙氨氨酸的底物优优先反应应。（1）相对专对专一性（2）酶的立体异构选择异构选择性：对对映体选择选择性（enantioselectivity）：酶在对称对称的外消旋化合物中识别

16、识别一种异构种异构体的能力大小的指标标，有机介质质中酶对对底物的对对映体选择选择性有机介质质的亲亲疏水性的变变化而发发生改变变。酶的对对映体选择选择性强弱可以用立体选择选择系数数KLD的大小来来衡量。（Kcat/Km）L（Kcat/Km）D KLD=式中 KLD 立体选择选择系数数 LL-型异构异构体 DD-型异构异构体 Km米氏常数数，酶催化反应应速度达达到最大速度一半时时的底物浓浓度。Kcat 酶的转换数转换数，指每个个酶分子每分钟钟催化底物转转化的分子数数。例：胰胰凝乳蛋白酶、胰胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等对对于底物N-Ac-Ala-OetCl（丙氨氨酸氯氯乙酯酯）的KLD在有机溶剂剂中为

17、为10以下，而在水中为为103 104数数量级级。（3）区区域选择选择性（regioselectivity）酶能够选择够选择底物分子中的某一区区域的基团优团优先进进行反应应，其选择选择性的强弱可以用区区域选择选择系数数Krs的大小来来衡量。（Kcat/Km）1（Kcat/Km）2=Krs例：用脂肪酶催化1，4-二丁酰酰基-2-辛基苯苯与与丁醇之间间的转酯转酯反应应，在甲苯苯介质质中，K4,1=2，表明酶优优先于底物C-4位上的酰酰基；而在乙腈腈介质质中,K4,1=0.5，则则表明酶优优先于底物C-1位上的酰酰基。概概念：酶催化非手性底物选择选择性地形成具有一定立体构构型的产产物。在疏水性差的溶

18、剂剂中，萘萘甲酰酰基进进入酶的疏水性袋中比暴露在溶剂剂中热热力学学平衡更为为有利。形成S型产产物。（4）前手性选择选择性：在疏水性强的溶剂剂中，萘萘甲酰酰基暴露在疏水性溶剂剂中，而不易进进入酶的疏水性袋中。第三节：有机介质中酶的催化特性酶的活性降低：（1）传质传质障碍（2）酶促反应应的活化能增加（3）活性中心的刚刚性增加（二）酶活性的变化（二）酶活性的变化第三节：有机介质中酶的催化特性酶的稳稳定性提高：（1）热稳热稳定性（2）储储存稳稳定性（3）对变对变性剂剂的稳稳定性（三）酶稳定性变化（三）酶稳定性变化 热稳热稳定性 在有机介质质中，酶的热稳热稳定性比水溶液中的增强，可能是由于有机介质质中缺

19、少引起酶分子失活变变性的水分子所致，水分子会会引起酶分子中的Asn和Gly失活变变性，Cys的氧氧化，二硫键键的破坏等。酶酶介质条件介质条件热稳定性热稳定性猪胰脂肪酶猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯 水，水，pH 7.0T1/226hT1/22min脂蛋白脂肪酶脂蛋白脂肪酶甲苯，甲苯，90，400h活力剩余活力剩余40%胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶正辛烷，正辛烷，100 水，水，Ph8.0，55 T1/2=80minT1/2=15min枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶正辛烷，正辛烷，110 T1/2=80min酸性磷酸酶酸性磷酸酶正十六烷，正十六烷，80 水，水，70 T1/2=8minT1/2=1

20、min（四）（四）pH记忆和分子印记记忆和分子印记 pH记忆记忆（pHimprinting）有机溶剂剂中的酶能够记忆它够记忆它冷冻冻干燥或丙酮酮沉淀前所在缓缓冲液中的pH值值，当当酶分子从从水溶液转转到有机溶剂时剂时，酶分子保留原有的pH印迹。分子印记记在有机介质质中从从含有竞争竞争性抑制剂剂的水溶液中冻冻干制备备的酶，在除去抑制剂剂后，酶分子记忆记忆原来来在水相中的一些特性的现现象。有机溶剂剂中酶活性与与酶干燥前或吸附于载载体前所在的缓缓冲液pH和离子强度相关关。酶能“记忆记忆”原缓缓冲液的pH，保持在原缓缓冲液中的构构象。利用酶的pH印迹特性，可以通过过控制缓缓冲液中pH值值的方法，达达到

21、控制有机介质质中酶催化反应应的最适pH值值。（五）反应平衡方向的移动（五）反应平衡方向的移动（六）酶促动力学的变化（六）酶促动力学的变化底物和有机溶剂的极性相似时：底物与溶底物和有机溶剂的极性相似时：底物与溶剂的亲和性高，底物和酶的亲和力降低。剂的亲和性高，底物和酶的亲和力降低。Km值增大值增大气相介质中的酶催化定义义 酶在气气相介质质中进进行的催化反应应优优点：气气体介质质的密度低，扩扩散容易用途：气气体或能转转化为气为气体为为底物的催化反应应超临界流体介质中的酶催化超临临界流体 温温度和压压力超过过某物质临质临界点的流体优优点：对对酶的结构结构无破坏作用；良好的化学稳学稳定性；超临临界温温度在酶反应应的最适温温度附近；超临临界压压力不能太高，节约动节约动力费费用；超临临界流体容易获获得，价格便宜。离子液介质中的酶催化离子液（ionic liquids）有机阳阳离子与与有机（无机）阴阴离子构构成的在 室温温下成液态态的低熔点盐类盐类，挥发挥发性低，稳稳 定性好。优优点：具有良好的稳稳定性和区区域选择选择性；立体选择选择性，键选择键选择性。思考题什么时么时疏水参数参数logP？非相水酶催化和水相酶催化相比的优势优势水在酶促反应应中的作用仿水溶剂剂在非水相酶催化中的作用举举例说说明如何选择选择酶催化有机体系中有机溶剂剂什么么是超临临界流体？超临临界流体中酶催化有那些特点？