普通PCR及测序PCR原理课件.ppt

1、PCR技术技术一一PCR概念PCR的原理PCR中的注意事项PCR的主要类型什么是什么是PCR?多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术，是一种在 DNA聚合酶作用下体外扩增特异片段的技术。PCR技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。PCR反应的几个要素反应的几个要素?DNA聚合酶聚合酶模板（要扩增的模板（要扩增的DNA）引物引物dNTPsBuffer（缓冲液）（缓冲液）2+Mg 等等生产机器生产机器模具模具原料原料稳定的环境稳定的环境

2、润滑剂润滑剂PCR反应步骤反应步骤9595（变性）（变性）5050（退火）（退火）7272（延伸）（延伸）PCR循环（循环（25-35个）个）(denaturaion)模板DNA95变性变性(annealing)引物1DNA引物引物250退火退火(extension)Taq酶引物1DNA引物引物2Taq酶72延伸延伸第1轮结束第2轮开始95模板DNA（1）第1轮扩增（2）轮扩增（4）?第2PCR反应条件?PCR过程?PCR的特点第4轮扩增（16）第5轮扩增（32=232=25 5）PCR的基本原理第3轮扩增（8）标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物上下游引物模板DNA T

3、aq DNA聚合酶Mg2+各200umol/L各10100pmol0.12ug2.5u1.5mmol/LPCR反应条件1）PCR反应成分（1）模板模板可以是DNA，也可以是RNA（反转录PCR），既可以是双链，也可以是单链。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100?L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）Taq DNA聚合酶（Taq酶）DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等等存在的情况下催化存在的情况下催化DNA的合成。的合成。Taq酶来自水生嗜热菌酶来自水生嗜热菌Thermus

4、aquaticus特点：特点：1.良好的耐热性良好的耐热性在在7080具有最高聚合活性具有最高聚合活性在在95 仍然可以有仍然可以有50%活性活性2.Mg2+依赖性依赖性3.扩增时扩增时3末端凸出一个末端凸出一个A 碱基碱基3.无校正功能无校正功能一般一般PCR中酶的用量为中酶的用量为0.5-2.5 U/50?l，酶量增加使反应，酶量增加使反应特异性下降，酶量过少影响反应产量。特异性下降，酶量过少影响反应产量。（3）引物引物浓度：0.1-0.5?mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。引物设计：引物设计：（1）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。）引物序列特异性好，与非扩增区

5、无同源性。（2）引物长度以）引物长度以15-40 bp为宜。为宜。（3）碱基尽可能随机分布，）碱基尽可能随机分布，G+C占占40-60%。（4）引物）引物Tm在在50-65之间，两条引物的之间，两条引物的Tm应接应接近，不能相差太大。近，不能相差太大。（5）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（6）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（7）引物）引物3 端与模板序列要严格配对，端与模板序列要严格配对，3 端避免出现端避免出现3个或个或3个以上连续相同的碱基个以上连续相同的碱基；引物；引物 5 端无严格限端无严格限制。制。353限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的

6、识别序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变探针标记探针标记5（4）dNTPdNTP：dATP，dTTP，dGTP，dCTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L 反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中 dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的 Mg2+浓度。（6 6）缓冲液（

7、）缓冲液（BufferBuffer）10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性（pH8.3,室温）50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会抑制Taq酶活性0.01%明胶保护酶不变性失活2）循环参数(1)变性使双链DNA解链为单链95oC 20-30秒(2)退火退火温度由引物Tm值决定，一般为Tm 510增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸（4）循环次数70-75oC(温度取决于聚合酶的活性）延伸时间由扩增片段长度及DNA聚合酶的延伸速度决定DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加

8、主要取决于模版一个典型PCR体系反应体系（50 ul）：Taq酶2.5 U10 x Buffer 5 uldNTP(2.5mM)4 ulDNA模板0.12ug上游引物(10P)2 ul下游引物(10P)2 ulH2O 补足至50 ul总计50 ul反应流程（以扩增片段大小为800bp为例）：955 min9530 s5530 s30个721 min循环725 min4-PCR的特点1.特异性强特异性强2.灵敏度高灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(?g=10-6)水平3.简便、快速简便、快速PCR反应一般在24 小时完成扩增反

9、应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广4.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA扩增检测PCR常见问题?假阴性，无扩增产物非特异性扩增?拖尾假阳性?无扩增产物?现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；原原因因1.1.模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降对对解解策策4.4.反应条件：反应条件

10、：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短1.1.纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2.2.更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物4.4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间?非特异性扩增现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大?或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现

11、特异性扩增带与非特异性扩增带。?非特异性扩增原原因因1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高对对5.5.退火温度偏低退火温度偏低策策6.6.循环次数过多循环次数过多1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数?拖尾现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝

12、胶上呈Smear状态状态。M12?拖尾原原因因1.1.2.2.3.3.4.4.5.5.6.6.模板不纯模板不纯BufferBuffer不合适不合适退火温度偏低退火温度偏低酶量过多酶量过多dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高循环次数过多循环次数过多1.1.2.2.对对策策3.3.4.4.5.5.6.6.纯化模板纯化模板更换更换BufferBuffer适当提高退火温度适当提高退火温度适量用酶适量用酶适当降低适当降低dNTPdNTP和镁离子的和镁离子的浓度浓度减少循环次数减少循环次数?假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)?现象：空白对照出现目的扩增产物空

13、白对照出现目的扩增产物?原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染?对策：1.1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。注意的事项注意的事项：（一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EP管一次性使用管一次性

14、使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照（二）设立对照阳性对照：阳性对照：阴性对照：阴性对照：试剂对照：试剂对照：阳性模板阳性模板阴性模板阴性模板除模板外的所有组分除模板外的所有组分PCR的类型及应用?研究?诊断 基因克隆，DNA测序，分析突变 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断?人类基因组工程?法医?肿瘤 犯罪现场标本分析 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱?其他 各种肿瘤检测PCR的不同类型的不同类型重组重组PCR不对称不对称PCR 反向反向PCR 多重多重PCR原位原位PCR 连接酶链反应连接酶链反应巢式巢式PCR 递减递减PCR热启动热启动PCR RT

15、PCR实时定量实时定量PCR重组PCR（基因克隆）质粒DNA基因片段重组DNABam H I55Bam H IBam H IBam H I质粒DNA目的基因限制性核酸内切酶GGACCCTGGTCCCAGGGGACGTCCCAGGGGACCCTGCAGGCCTGGTCC不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链 DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究低浓度引物高浓度引物反向反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)

16、是用反向的互补引物来扩增两引物以外的 DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入 DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶未知序列已知序列未知序列连接酶多重PCR用于检测特定基因序列的存在或缺失。引物电电泳泳原位原位聚合酶链式反应（In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。

17、直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列操作步骤固定组织或细胞固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.蛋白酶蛋白酶K K消化处理消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K.PCRPCR扩增扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置.杂交杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交原位P

18、CR的作用既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片LCRLCR连接酶链反应连接酶链反应LCR（Ligase chain reaction）基本原理为利用DN

19、A连接酶.特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增.若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物.LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为2026个，以保证引物与靶序列的特异性结合，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性.LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高.LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94min变性和65复性并连接，循环30次左右.目前该方法主要用点突变

20、的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等.LP（Labelled primers)检测利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4PCR产物观察观察标记引物标记引物巢式巢式PCRPCR（Nest-PCRNest-PCR）P1P3P4P2?巢式巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。套引物都互补的靶序列很少。?巢式巢式P

21、CR可以增加有限量靶序列可以增加有限量靶序列（如稀有如稀有mRNA）的灵敏度，的灵敏度，并且提高了困难并且提高了困难PCR（如如5 RACE）的特异性。）的特异性。递减递减PCRPCR（TouchDownTouchDown PCRPCR）?递减递减PCR通过在通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的特异性。循环设在比估算的 TmTm高大约高大约5的退火温度下开始，的退火温度下开始，然后每个循环降低然后每个循环降低1 1-2 2,直到退火温度低于直到退火温度低于TmTm5。?特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循特异性

22、最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。环中继续扩增占据优势。?递减递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。指纹分析等。热启动热启动PCR PCR（HotStart PCRHotStart PCR）?热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，合成，直到直到PCR仪达到变性温度；仪达到变性温度；现在有很多公司都有现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合

23、于高通量应用启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；?热启动热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性特异性最重要的方法之一。最重要的方法之一。RT-PCRRT-PCRRNARNA的多聚酶反应（的多聚酶反应（RT-PCRRT-PCR）是以）是以RNA RNA 为模板，为模板，联合逆转录反应（联合逆转录反应（r reverse everse t transcriptionranscription，RTRT）与与PCRPCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 1010个拷贝的个拷贝的RNARNA模板模板。RNARNA扩

24、增步骤：扩增步骤：?在在单引物单引物的介导下和的介导下和逆转录酶逆转录酶的催化下，合成的催化下，合成RNARNA的互补的互补cDNAcDNA?加热后加热后cDNAcDNA与与RNARNA链解离，然后与另一引物退火，链解离，然后与另一引物退火，并由并由DNADNA聚合酶聚合酶催化引物延伸生成双链靶催化引物延伸生成双链靶 DNADNA?最后扩增靶最后扩增靶DNADNARNAcDNARNARNA逆转录酶反转录引物反转录引物杂合双链杂合双链聚合酶PCR扩增逆转录酶：逆转录酶：1.禽类成髓细胞病毒禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶，活性包括依赖于逆转录酶，活性包括依赖于RNA的的DNA合成，依赖于合成，

25、依赖于DNA的的 DNA合成以及对合成以及对DNA:RNA杂交体杂交体的的RNA部分进行内切降解部分进行内切降解(RNA酶酶H活性活性)。2.鼠白血病病毒鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。反转录酶。MLV反转录酶兼备依赖于反转录酶兼备依赖于RNA和依赖于和依赖于DNA的的DNA合成活性，但降解合成活性，但降解RNADNA杂交体杂交体中的中的RNA的能力较弱。的能力较弱。普通逆转录酶反应温度为普通逆转录酶反应温度为37-42度，所以反转录的延伸温度一度，所以反转录的延伸温度一般都是般都是37或或42 。3.逆转录反应的一般步骤逆转录反应的一般步骤1.2.RNA模板模板+反转录引物，反转录引物，70

26、，5min,冰浴冰浴1min。再加以下反应组分：再加以下反应组分：BufferdNTP逆转录酶抑制剂逆转录酶抑制剂逆转录酶逆转录酶以上组分加好后，混匀，以上组分加好后，混匀，42或或37 60min。70，5min 后再冰浴，所得产物就是后再冰浴，所得产物就是cDNA，cDNA用做后面的用做后面的PCR的模板。的模板。3.4.一步法：一步法：利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、酶、4种种dNTP 直接进行直接进行mRNA反转录与反转录与PCR扩增。发现扩增。发现Taq酶不仅具有酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活

27、性，可利用其双重作用在多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而扩增，从而使使mRNA的的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于中小于1ng的低丰度的低丰度mRNA。该法可用于低丰度。该法可用于低丰度mRNA的的cDNA文库的构建及文库的构建及特异特异cDNA的克隆，并有可能与的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动酶

28、的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。两步法：两步法：由于单管反应时由于单管反应时RT和和PCR都不能在最佳条件下进行并且都不能在最佳条件下进行并且容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量因，及定量PCR。两步法则是将。两步法则是将RT和和PCR分别进行，这分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知含量、二级结构严重

29、的模板或者是未知模板，以及多个基因的模板，以及多个基因的RT-PCR。二二、测序原理、测序原理双脱氧核苷酸终止测序法（也叫 sanger测序法）的原理是：在PCR体系中加入双脱氧核苷酸（ddNTP），在PCR延伸过程中ddNTP随机掺入到合成链中从而导致延伸的终止，经过大量的这样随机终止的 PCR反应，生成一系列长度相差1个碱基的PCR产物混合物，此产物通过电泳根据不同长度片段的电泳速度不同来检测整段DNA的序列。dNTP与与ddNTP双脱氧终止法示意普通dNTP 3端羟基在聚合酶作用下与下一碱基 5端磷酸基团结合形成磷酸二酯键，DNA 链得以延伸ddNTP 被去掉 3端羟基，无法与后继的dN

30、TP结合形成磷酸二酯键，所以DNA链被终止双脱氧终止法示意5?脱氧核苷酸脱氧核苷酸（dNTP）的连接的连接PCO碱基碱基4321OHHOHP5CO碱基碱基4321OHH双脱氧终止法示意5?脱氧核苷酸（脱氧核苷酸（dNTP）的连接）的连接PCO碱基碱基4321OHHOHDNA聚合酶聚合酶P5CO碱基碱基4321OHH双脱氧终止法示意P45C3?双脱氧核苷酸（双脱氧核苷酸（ddNTP）O2H1碱基碱基HOHDNA聚合酶聚合酶5C43OHO2H1P碱基碱基双脱氧终止法测序反应组分?模板预备测序的双链或单链DNA?引物在模板上已知区域设计的测序引物，引物确定了测序的方向方向和位置位置?dNTP?ddN

31、TP脱去3端羟基的 dNTP，并且4种不同的ddNTP上标记有4种不同颜色的荧光标记?DNA聚合酶?缓冲液为DNA聚合酶提供工作条件测序组分示意图测序组分示意图模板模板DNA聚合酶聚合酶引物引物因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。测序反应示意图测序反应示意图在引物延伸反应过在引物延伸反应过程中，程中，dNTP和和ddNTP是是相互竞争相互竞争地掺入到延地掺入到延伸链的伸链的3 端的，因而端的，因而ddNTP在不同位置掺入，在不同位置掺入，就产生了一系列不同长就产生了一系列不同长度的新的度的新的DNA片段。片段。测序测序PCR产物电泳分离示意图产物电泳分离示意图不同片段长度的测不同片段长

32、度的测序产物因大小不同而电序产物因大小不同而电泳速度不同，从小到大泳速度不同，从小到大先后通过测序仪的荧光先后通过测序仪的荧光检测窗口，并根据检测检测窗口，并根据检测的荧光信号颜色来读取的荧光信号颜色来读取通过片段的末端的碱基通过片段的末端的碱基序列，一系列相差序列，一系列相差1个个碱碱基的片段依次通过，则基的片段依次通过，则就可以读出整个模板片就可以读出整个模板片段的序列。段的序列。测序仪基本构造示意图1 电进样及电泳电进样及电泳1.毛细管和电极深入样品溶液中2.加电压3.荷负电的DNA分子进入毛细管在电场作用下向阳极泳动2 荧光激发和检测荧光激发和检测1.分别带4色荧光标记的DNA片段从小

33、到大依次经过激光检测区2.激光激发荧光产生长波长的荧光信号3.荧光信号被冷CCD收集4.软件将光学信号转换成电泳图谱PCR扩增与扩增与DNA测序反应的区别测序反应的区别类型类型产物增加方式产物增加方式PCR指数指数测序反应测序反应PCR线性线性模板量模板量引物引物dNTPdNTPddNTPddNTP酶酶退火温度退火温度退火时间退火时间少少一对一对有有无无TaqTaq酶酶根据引物退火温度而定根据引物退火温度而定根据片段大小而定根据片段大小而定多多一个一个有有有，带荧光标记有，带荧光标记测序酶（测序酶（T7 DNAT7 DNA聚合酶）聚合酶）5050度度固定固定延伸温度延伸温度延伸时间延伸时间产物大小产物大小767272度度根据片段大小而定根据片段大小而定长度一致长度一致6060度度固定固定相差一个碱基的一系列片段相差一个碱基的一系列片段