抗体酶与酶的修饰及活性调节课件.pptx
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《抗体酶与酶的修饰及活性调节课件.pptx》由用户(晟晟文业)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 抗体酶 修饰 活性 调节 课件
- 资源描述:
-
1、抗抗 体体 酶酶(abzyme)(catalytic antibody)知知 识识 要要 点点1、什么是什么是抗体酶抗体酶?2、抗体抗体和和酶酶的特点比较的特点比较3、抗体酶的抗体酶的作用特点作用特点4、抗体酶的抗体酶的制备制备5、抗体酶的抗体酶的应用前景应用前景什么是什么是抗体酶抗体酶?在免疫球蛋白的在免疫球蛋白的易变区易变区赋予赋予酶的属性酶的属性,成为具,成为具有有催化活性的抗体催化活性的抗体生物学生物学与与化学化学的研究成果的研究成果在分子水平上在分子水平上交叉的交叉的产物产物抗体的抗体的多样性多样性+酶分子的酶分子的高效催化高效催化=新酶设计新酶设计酶反应酶反应过渡态类似物过渡态类似
2、物作为作为半抗原半抗原免疫动物产生有催化免疫动物产生有催化活性的抗体,采用活性的抗体,采用单克隆抗体技术单克隆抗体技术获得这种具有酶特获得这种具有酶特性的抗体。性的抗体。基本概念基本概念免疫免疫?抗体抗体?抗原抗原?半抗原半抗原?多克隆抗体多克隆抗体?单克隆抗体单克隆抗体?免疫系统和免疫球蛋白功能免疫系统和免疫球蛋白功能 免疫免疫是人类和脊椎动物最重要的防御机制,免疫系统能在分子水平上是人类和脊椎动物最重要的防御机制,免疫系统能在分子水平上识别识别“自我自我”和和“非我非我”,然后破坏那些被鉴定为非我的,然后破坏那些被鉴定为非我的成分成分。在生理水。在生理水平上免疫系统对入侵的反应或应答是多种
3、类型的蛋白质、分子和细胞之间平上免疫系统对入侵的反应或应答是多种类型的蛋白质、分子和细胞之间的一套复杂而协同的相互作用,的一套复杂而协同的相互作用,如果从如果从个别蛋白质水平个别蛋白质水平来看,来看,免疫反应免疫反应可可以看作是一种以看作是一种配体与蛋白质可逆结合的生化系统。配体与蛋白质可逆结合的生化系统。1抗原、抗体和免疫球蛋白的概念抗原、抗体和免疫球蛋白的概念2免疫球蛋白的类别免疫球蛋白的类别3免疫球蛋白结构和免疫系统免疫球蛋白结构和免疫系统4多克隆抗体和单克隆抗体多克隆抗体和单克隆抗体什么是什么是“免疫球蛋白免疫球蛋白”?(immunoglobulin)具有抗体活性的动物蛋白具有抗体活性
4、的动物蛋白,是一种糖蛋白。主要存在于是一种糖蛋白。主要存在于血浆中,也见于其他体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白大血浆中,也见于其他体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白(多数存在于丙种球蛋白(-球蛋白)中。可分为球蛋白)中。可分为五类五类,即免疫球蛋白,即免疫球蛋白G G(IgG)、免疫球蛋白)、免疫球蛋白A A(IgA)、免疫球蛋白)、免疫球蛋白M M(IgM)、免疫球蛋白)、免疫球蛋白D D(IgD)和免疫球蛋白)和免疫球蛋白E E(IgE)。其中)。其中IgG是最主要的免疫球蛋白,约占人是最主要的免疫球蛋白,约占人血浆丙种球蛋白的血浆丙种球蛋白
5、的70%70%,分子量约,分子量约1515万,含糖万,含糖2 23%3%。IgGIgG分子由分子由4 4条肽链组条肽链组成。其中分子量为成。其中分子量为2.52.5万的肽链,称轻链,分子量为万的肽链,称轻链,分子量为5 5万的肽链,称重链。轻万的肽链,称重链。轻链与重链之间通过二硫键(链与重链之间通过二硫键(S SS S)相连接。免疫球蛋白是机体受抗原)相连接。免疫球蛋白是机体受抗原(如病原体)刺激后产生的,其主要作用是与抗原起免疫反应,生成抗原(如病原体)刺激后产生的,其主要作用是与抗原起免疫反应,生成抗原-抗体复合物,从而阻断病原体对机体的危害,使病原体失去致病作用。另一抗体复合物,从而阻
6、断病原体对机体的危害,使病原体失去致病作用。另一方面,免疫球蛋白有时也有致病作用。临床上的过敏症状如花粉引起的支气方面,免疫球蛋白有时也有致病作用。临床上的过敏症状如花粉引起的支气管痉挛,青霉素导致全身过敏反应,皮肤荨麻疹(俗称风疹块)等都是由免管痉挛,青霉素导致全身过敏反应,皮肤荨麻疹(俗称风疹块)等都是由免疫球蛋白制剂能增强人体抗病毒的能力,可作药用。如注射人血清或人胎盘疫球蛋白制剂能增强人体抗病毒的能力,可作药用。如注射人血清或人胎盘中提取的丙种球蛋白制剂可防治麻疹、传染性肝炎等传染病。中提取的丙种球蛋白制剂可防治麻疹、传染性肝炎等传染病。人免疫球蛋白的分类人免疫球蛋白的分类 IgG I
7、gA IgM IgD IgE重链类别重链类别轻链类别轻链类别 或或 或或 或或 或或 或或链的组成链的组成 2222n22522522n2222222222免疫球蛋白免疫球蛋白IgG的一级结构的一级结构 IgG结构 IgM的一级结构的一级结构IgG的空间结构的空间结构IgG与抗原形成与抗原形成 的交联晶格的交联晶格多克隆抗体和单克隆抗体多克隆抗体和单克隆抗体 如果给动物注射抗原如果给动物注射抗原,虽然抗原与各种抗体产生细胞的亲和虽然抗原与各种抗体产生细胞的亲和性有所不同性有所不同,但是还是有大量抗体产生细胞将与之结合但是还是有大量抗体产生细胞将与之结合,结果血结果血液中出现的抗体源于数种不同的
8、细胞克隆,这些抗体就是液中出现的抗体源于数种不同的细胞克隆,这些抗体就是多克多克隆抗体隆抗体(polyclonal antibodies)。如果可以分离到抗体产生细)。如果可以分离到抗体产生细胞的单克隆,然后使所有的抗体均来自同样的克隆,这样制备胞的单克隆,然后使所有的抗体均来自同样的克隆,这样制备的抗体称为的抗体称为单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibodies)。)。由于单抗细胞的寿命有限,严重限制了单抗的常规制备。由于单抗细胞的寿命有限,严重限制了单抗的常规制备。1975年,年,Milsetein和和Kohler创建了不受限制地大量制备针对特创建了不受限制地大量制备针对
9、特异抗原的单抗技术,将可产生专一性抗体的异抗原的单抗技术,将可产生专一性抗体的B淋巴细胞与具有淋巴细胞与具有无限繁殖能力的恶性淋巴瘤细胞(骨髓瘤细胞)融合,融合体无限繁殖能力的恶性淋巴瘤细胞(骨髓瘤细胞)融合,融合体称为杂交瘤细胞,它既可以永久地培养,又可分泌大量的均一称为杂交瘤细胞,它既可以永久地培养,又可分泌大量的均一的抗体。由于用这个技术产生的抗体具有很高的专一性,现已的抗体。由于用这个技术产生的抗体具有很高的专一性,现已成为研究的常用工具。成为研究的常用工具。抗体抗体和和酶酶的特点比较的特点比较 酶酶 抗体抗体底物结合专一性 比较高 非常高非常高底物结合形变 容易变形 不易变形种类 比
10、较多 非常多非常多物质转变活性 高 无 如何将如何将抗体抗体转变成转变成酶?酶?19481948年年Linus Pauling提出了提出了酶的过渡态催化理酶的过渡态催化理论论,认为酶和底物结合认为酶和底物结合不是在基态上不是在基态上,因为酶与,因为酶与基态底物的结合十分困难,需要克服很大的能障。基态底物的结合十分困难,需要克服很大的能障。过渡态结构过渡态结构十分容易与酶结合,因为酶结构经过十分容易与酶结合,因为酶结构经过底物诱导等,亲和力最强。十分容易越过能障,底物诱导等,亲和力最强。十分容易越过能障,加速催化速度。加速催化速度。所以酶具有催化速度快和高选择性(专一性)所以酶具有催化速度快和高
11、选择性(专一性)在没有催化剂存在的情况下,能障(即活化能)是在没有催化剂存在的情况下,能障(即活化能)是S S和和S S之间的能量差。在有酶催化时,能障是之间的能量差。在有酶催化时,能障是ESES和和ESES间间的能量差。这种能量差越小,过渡态就越容易达到,过的能量差。这种能量差越小,过渡态就越容易达到,过渡态的浓度越高,反应速度就越快。渡态的浓度越高,反应速度就越快。ESES具有的自由能显然比具有的自由能显然比S S的低。的低。ESES与过渡态(与过渡态(ESES)是不同的概念。酶促反)是不同的概念。酶促反应速度由应速度由ESES和和ESES之间的能量差决定!这个差值之间的能量差决定!这个差
12、值越小,酶促反应速度就越快。越小,酶促反应速度就越快。在有催化剂存在下,在有催化剂存在下,ESES和和ESES之间的能量差显著减小之间的能量差显著减小 ESES复合物是不稳定的复合物是不稳定的,它容易解离成,它容易解离成 E ES S。在。在ESES复合物中,底物与酶的结合并不是处复合物中,底物与酶的结合并不是处于最适状态,即不是处于完全互补的状态。换于最适状态,即不是处于完全互补的状态。换句话说,酶活性部位的基团以及能与底物发生句话说,酶活性部位的基团以及能与底物发生弱的相互作用的氨基酸残基并未全部参与到同弱的相互作用的氨基酸残基并未全部参与到同底物的结合中去。底物的结合中去。只有当只有当E
13、SES进行转变,进入到进行转变,进入到转换态转换态ESES,才能使底物处于一种最适的结合,才能使底物处于一种最适的结合状态。状态。这就是说,这就是说,底物与过渡态的底物与过渡态的酶酶是互补的是互补的!应当注意!应当注意!转换态本身是不稳定的,但由转换态本身是不稳定的,但由于转换态与酶的互补结合是由众多的相互作用于转换态与酶的互补结合是由众多的相互作用所释放出的能量所释放出的能量(即所谓结合能即所谓结合能)使转换态变得使转换态变得稳定。稳定。在7080年代,W.P.Jencks预言,抗某个反应过抗某个反应过 渡态的抗体具有催化该反应的能力渡态的抗体具有催化该反应的能力。1975年前后,抗体酶处于
14、探索的开始阶段,一般 采用诱导法诱导法、引入法引入法进行尝试,一般效率很低效率很低,有的还测定不出活性有的还测定不出活性。主要原因是具有催化活性 的抗体太少,在大量的抗体中只有少数几个有活性,甚至都没有活性。1975年时,G.Kohler&C.Milstein 发明了单克单克 隆抗体技术后隆抗体技术后,就有了后来的抗体酶。1986年,美国的Schultz小组研究“对硝基苯酚磷酸胆碱脂(pNPPC)”相应的羧酸二酯水解反应的过渡态类似物时,推测用这个过渡态类似物作半抗原 这样的分析,后来的确从中 选出了两株有催化活性的单 克隆抗体,一株MOPC167的 水解速度达到了1.2x104倍。经过测定,
15、这个抗体 酶符合米氏方程,具有底物专一性需要一定的温 度等酶的催化特征。结果表明底物类似物的结构与抗体酶有关。结果表明底物类似物的结构与抗体酶有关。另一实验:合成一个含吡啶甲酸的磷酸酯化合物合成一个含吡啶甲酸的磷酸酯化合物 用这个用这个过渡态类似物过渡态类似物作半抗原免役小鼠,得到作半抗原免役小鼠,得到1212株单抗。株单抗。结果结果:3 3株有抗体酶活性,其中一株株有抗体酶活性,其中一株6D46D4能与半抗原能与半抗原分子结合外,还能催化不含吡啶甲酸的相应磷酸分子结合外,还能催化不含吡啶甲酸的相应磷酸酯化合物水解,速度快酯化合物水解,速度快10103 3倍,具有底物专一性和倍,具有底物专一性
16、和对对pHpH的依赖性。的依赖性。用半抗原可以竞争性地抑制这个反应。用半抗原可以竞争性地抑制这个反应。还发现单抗的结合位点的氨基酸改变,可以还发现单抗的结合位点的氨基酸改变,可以影响它的催化活性。影响它的催化活性。后来,有了成功的经验后,抗体酶的研究文后来,有了成功的经验后,抗体酶的研究文章越来越多。章越来越多。抗体酶的作用特点:抗体酶的作用特点:在在专一性专一性方面方面超过或相当于超过或相当于我们讲的普通酶。我们讲的普通酶。在在反应速度反应速度方面接近普通酶,目前在总体上要方面接近普通酶,目前在总体上要低一些低一些。原因:原因:抗体酶没有抗体酶没有结构诱导结构诱导等动态变化;等动态变化;产物
17、释放困难;产物释放困难;底物、产物的交换困难。底物、产物的交换困难。抗体酶的抗体酶的制备制备一、酶蛋白诱导法一、酶蛋白诱导法二、半抗原诱导法二、半抗原诱导法三、抗体分子修饰法(引入法)三、抗体分子修饰法(引入法)O C A.酯酶的底酯酶的底 物物酯酯B.酯的羧基碳酯的羧基碳原子受到亲核原子受到亲核攻击形成四面攻击形成四面体过渡态体过渡态C.设计的磷酸设计的磷酸酯类似物酯类似物,作作为抗原去免疫为抗原去免疫实验动物实验动物磷酸酯类似物磷酸酯类似物(半抗原半抗原)对酯水解反应有催化对酯水解反应有催化作用的单克隆作用的单克隆抗体抗体免疫免疫免疫反应免疫反应诱导法制备具有诱导法制备具有酯酶活性酯酶活性
18、的抗体的抗体 酶蛋白诱导法(拷贝法)酶蛋白诱导法(拷贝法)用用已知的酶已知的酶作为作为抗原抗原对动物进行第一次免疫对动物进行第一次免疫,获得获得该酶该酶的抗体的抗体;再用这种抗体作为抗原进行第二次免疫获得再用这种抗体作为抗原进行第二次免疫获得抗抗抗体抗体,抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。优点优点:可以大量生产单克隆的抗体酶可以大量生产单克隆的抗体酶缺点缺点:有相当大的盲目性和偶然性,并不能产生新酶。有相当大的盲目性和偶然性,并不能产生新酶。酶酶第一次免疫第一次免疫抗酶抗体抗酶抗体第二次免疫第二次免疫抗体酶抗体酶拷贝法制备抗体酶拷贝法制备抗体酶 半
19、抗原诱导法(细胞融合法)半抗原诱导法(细胞融合法)先用特定的半抗原(过渡态底物决定)与载体蛋白相连(如牛血清白蛋白等)。此 偶联的物质作为抗原 免疫动物,产生抗体 产生抗体的脾脏细胞与骨髓融合,然后在体外培养,杂交体克隆化,然后繁殖成单一细胞或菌落单一细胞或菌落产生抗体。用标准单克隆抗体技术来制备、分离、筛选抗体酶关键关键:用什么样的抗原才能诱导出具有特定的酶催化功能的抗体?即由抗体向酶即由抗体向酶 的转变过程的转变过程。aa过渡态类似物过渡态类似物载体蛋白载体蛋白抗体酶抗体酶半抗原诱导法制备抗体酶半抗原诱导法制备抗体酶引入法引入法(辅助因子辅助因子):是用选择性的化学修饰、基因工程或者蛋白质
20、工程方法,将催化是用选择性的化学修饰、基因工程或者蛋白质工程方法,将催化基团和辅助因子引入抗体的抗原结合部位。基团和辅助因子引入抗体的抗原结合部位。SchultzSchultz等人在等人在IgAMOP315抗体结合部位选择性引入抗体结合部位选择性引入巯基巯基,然后,然后用亲和色谱纯化。结果:它水解香豆酯的速度比对照高用亲和色谱纯化。结果:它水解香豆酯的速度比对照高6 610104 4倍倍酶的活性中心很多有酶的活性中心很多有金属离子金属离子。LernerLerner等将金属离子引入抗体酶,等将金属离子引入抗体酶,成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙撑胺成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙
21、撑胺CoCo3+3+盐作为金盐作为金属离子辅因子,半抗原分子带有一肽键属离子辅因子,半抗原分子带有一肽键,通过羧酸根及仲胺基与通过羧酸根及仲胺基与金属离子相连金属离子相连,再共价连接在载体蛋白上,免疫动物后产生的抗再共价连接在载体蛋白上,免疫动物后产生的抗体,在金属离子复合物作为辅因子的参与下,这些抗体酶能选择体,在金属离子复合物作为辅因子的参与下,这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键,其转化数达性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键,其转化数达6 610104 4。吸毒是一个困绕着很多国家的难题,尤其是吸毒上吸毒是一个困绕着很多国家的难题,尤其是吸毒上瘾后很难戒掉。目前,直接拮抗可卡因上瘾
22、的抗体瘾后很难戒掉。目前,直接拮抗可卡因上瘾的抗体还没有找到。还没有找到。替换的方法是阻断可卡因、鸦片和受体的结合。虽替换的方法是阻断可卡因、鸦片和受体的结合。虽说抗鸦片的抗体能有效拮抗注射海洛因上瘾的猴子,说抗鸦片的抗体能有效拮抗注射海洛因上瘾的猴子,然而由于抗体和抗原形成复合物后不能再生,必须然而由于抗体和抗原形成复合物后不能再生,必须使用高剂量的抗体使用高剂量的抗体,使这一应用受到限制。使这一应用受到限制。抗体酶则不一样,不但能和抗原结合,而且能使抗抗体酶则不一样,不但能和抗原结合,而且能使抗原水解而再生,这不但能减少抗体酶的用量,也能原水解而再生,这不但能减少抗体酶的用量,也能减少抗体
23、酶的免疫原性。因此比其它抗体临床应用减少抗体酶的免疫原性。因此比其它抗体临床应用前景更好。前景更好。抗体酶用于戒毒抗体酶用于戒毒LandryLandry等用可卡因水解的等用可卡因水解的过渡态类似物过渡态类似物-磷酸单酯磷酸单酯为半抗原为半抗原,产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解,产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解,其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多,水解后的可卡因片断失去了可卡因刺激功能。不多,水解后的可卡因片断失去了可卡因刺激功能。因此,用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因因此,用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾,达到戒毒目
24、的。上瘾,达到戒毒目的。酶活性的调节酶活性的调节一、一、共价修饰酶共价修饰酶活性的调节活性的调节二、二、酶原酶原活性的调节活性的调节三、三、同工酶同工酶与酶活性调节与酶活性调节四、四、激活剂激活剂和和抑制剂抑制剂对酶活性的调节(略)对酶活性的调节(略)共价修饰酶活性的调节共价修饰酶活性的调节 某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰,使其处于活性与非活性的互变状态,从而调节酶活性价修饰,使其处于活性与非活性的互变状态,从而调节酶活性。这类酶称为。这类酶称为共价修饰酶共价修饰酶。目前发现有数百种酶被翻译后都要。目前发现有数百种
25、酶被翻译后都要进行共价修饰,其中一部分处于分支代谢途径,成为对代谢流进行共价修饰,其中一部分处于分支代谢途径,成为对代谢流量起调节作用的量起调节作用的关键酶或限速酶关键酶或限速酶。由于这种调节的生理意义广泛,反应灵敏,节约能量,机制多样,在体由于这种调节的生理意义广泛,反应灵敏,节约能量,机制多样,在体内显得十分灵活,加之它们常受激素甚至神经的指令,导致级联放大反应,内显得十分灵活,加之它们常受激素甚至神经的指令,导致级联放大反应,所以日益引人注目。所以日益引人注目。AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g关键酶(限速酶)关键酶(限速酶)P2蛋白激酶蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质蛋白质蛋白
展开阅读全文