基因工程的质粒载体课件.ppt

1、按载体功能分按载体功能分按载体性质分按载体性质分（四）（四）基因工程中常用的载体有基因工程中常用的载体有5类：类：质粒（质粒（plasmid）单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid）动物病毒（动物病毒（virus）载体的种类和特征载体的种类和特征第一节第一节 质粒载体质粒载体 一、质粒（一、质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状双链闭合环状DNA分子。分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒在大肠杆菌的各种菌

2、体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有经作了比较详尽研究的主要有F质粒、质粒、R质粒和质粒和Col质粒。质粒。F质粒质粒 又叫又叫F因子或性质粒（因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主）。它们能够使寄主染色体上的基因和染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。胞中去。R质粒质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细因，并且通

3、常能够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。Col质粒质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。（1）分子小：）分子小：1.质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1200 kb（2）编码基因少：）编码基因少：23个中等大小的蛋白质。个中等大小的蛋白质。（3）环形状：）环形状：双链环状双链环

4、状DNA。（酵母的（酵母的“杀伤质粒杀伤质粒”是是RNA）。）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。一些额外的特性（非必须）。1当其两条多核苷酸链均保持着完当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为整的环形结构时，称之为共价闭合环共价闭合环形形DNA（cccDNA），），这样的这样的DNA通常呈现通常呈现超螺旋的超螺旋的SC构型构型；2如果两条多核苷酸链中只有一条如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为现有一至数个缺口时，称之为开环开环DNA（ocDN

5、A），），此即此即OC构型；构型；3若质粒若质粒DNA经过适当的核酸内切经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子线性分子（IDNA），通称），通称L构型构型（4）质粒的空间构型：）质粒的空间构型：（5）质粒空间构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是前沿的是SCDNA，其后依次是，其后依次是L DNA和和OC DNA SCOCL（1）质粒的类型：在

6、大肠杆菌中的质粒，可）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：以分为：接合型质粒接合型质粒:非接合型质粒非接合型质粒能自我转移能自我转移不能自我转移不能自我转移2 质粒质粒DNA的转移的转移除了带有自我除了带有自我复制复制所必需的遗传信息外还带所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌有一套控制细菌配对配对和质粒和质粒接合转移接合转移的基因。的基因。如：如：F质粒（性质粒、或质粒（性质粒、或F因子）：因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。转移到原先不存在该质粒的受体菌中。又叫又叫自我转移型质粒自我转移型质粒。（1.1）接合型质

7、粒接合型质粒不符合基因工程的安全要求。不符合基因工程的安全要求。（2）F质粒质粒(F plasmid)又称又称F因子、致育因子或性因子，是大肠杆菌等细菌决定性别因子、致育因子或性因子，是大肠杆菌等细菌决定性别并有转移能力的质粒。分子量约为大小并有转移能力的质粒。分子量约为大小94kb，共编码，共编码19个转个转移基因。移基因。F质粒在寄主细胞中有三种存在形式：质粒在寄主细胞中有三种存在形式：以染色体外环形双链质粒以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带来自寄主染形式存在，不带来自寄主染色体的基因或色体的基因或DNA区段。区段。以染色体外环形双链质粒以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，携带着

8、细菌的染形式存在，携带着细菌的染色体基因或色体基因或DNA区段。区段。以线性以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上。形式从不同位点整合到寄主染色体上。F质粒结构：质粒结构：tra区（转移区，与质区（转移区，与质粒转移和性菌毛合成粒转移和性菌毛合成有关）有关）oriT（转移起始点）（转移起始点）oriS复制起始点）复制起始点）inc（不相容群）（不相容群）rep（复制功能）（复制功能）转座因子转座因子根据根据F质粒在细胞中的存在方式，可把大肠杆菌分成四种不同接质粒在细胞中的存在方式，可把大肠杆菌分成四种不同接合型菌株。合型菌株。（1）F+菌株菌株F+菌株即菌株即“雄性雄性”菌株，指细胞内存

9、在一至几个菌株，指细胞内存在一至几个F质粒，并在细质粒，并在细胞表面着生一至几条性菌毛的菌株。胞表面着生一至几条性菌毛的菌株。（2）F-菌株菌株F-菌株即菌株即“雌性雌性”菌株，指细胞中无菌株，指细胞中无F质粒、细胞表面也无性菌质粒、细胞表面也无性菌毛的菌株。毛的菌株。（3）Hfr菌株（高频重组菌株）菌株（高频重组菌株）在在Hfr菌株（高频重组菌株）细胞中，因质粒由游离态转为在菌株（高频重组菌株）细胞中，因质粒由游离态转为在核染色体组特定位点上的整合态，故核染色体组特定位点上的整合态，故Hfr菌株与菌株与F-菌株相接合菌株相接合后，发生基因重组的频率比单纯用后，发生基因重组的频率比单纯用F+与

10、与F-接合后的频率高出接合后的频率高出数百倍。数百倍。（4）F菌株菌株当当Hfr菌株细胞内的菌株细胞内的F质粒因不正常切离而脱离核染色体组时，质粒因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的、但携带整合位点邻近一小段核染色体基因可重新形成游离的、但携带整合位点邻近一小段核染色体基因的特殊的特殊F质粒，称质粒，称F质粒或质粒或F因子。因子。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌于性须的作用，就会形成雌-雄细胞配对，这种过程称雄细胞配对，这种过程称为细菌的接合作用（为细菌的接合作用（conjunction）。）。

11、F因子因子DNA拷贝，需拷贝，需1分钟时间从雄性细胞转移到雌性细胞分钟时间从雄性细胞转移到雌性细胞（3）质粒）质粒DNA的接合转移的接合转移细胞交配对的形成细胞交配对的形成 雄性细胞的性须顶端与受体细胞表面接触之后，便会迅速收缩，雄性细胞的性须顶端与受体细胞表面接触之后，便会迅速收缩，把给体细胞与受体细胞拉在一起。因此，性须在确立配对细胞把给体细胞与受体细胞拉在一起。因此，性须在确立配对细胞表面间的紧密接触方面，起着至关重要的作用。表面间的紧密接触方面，起着至关重要的作用。大肠杆菌雄性细胞是不会同其它的亦带有大肠杆菌雄性细胞是不会同其它的亦带有F质粒的细胞发质粒的细胞发生配对作用的，因为生配对

12、作用的，因为traS和和traT编码的编码的“表面排斥表面排斥”蛋白质，蛋白质，使此种细胞无法成为接合作用的受体。这就决定了雄性细胞只使此种细胞无法成为接合作用的受体。这就决定了雄性细胞只能同不具能同不具F因子的雌性细胞配对的特异性。因子的雌性细胞配对的特异性。质粒质粒DNA的转移的转移 F质粒质粒DNA的转移是从转移起点的转移是从转移起点oriT开始的。当细胞交配对建开始的。当细胞交配对建立之后，立之后，TraY和和TraI蛋白质首先在蛋白质首先在oriT位点作单链切割，随后位点作单链切割，随后缺口链在其游离的缺口链在其游离的5-端的引导下转移到受体细胞，并作为模端的引导下转移到受体细胞，并

13、作为模板合成互补链，形成新的质粒分子。于是受体细胞便转变成为板合成互补链，形成新的质粒分子。于是受体细胞便转变成为具有具有F因子的雄性细胞。因子的雄性细胞。2.非接合型质粒：非接合型质粒：虽然带有自我虽然带有自我复制复制所必需的遗传信息，但失所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合去了控制细菌配对和质粒接合转移转移的基因，的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。（1）R质粒（抗性质粒）：质粒（抗性质粒）：带有一种或数种带有一种或数种抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主获，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（得同样的抗生素抗性性状（resistance

14、）。）。符合基因工程的安全要求。符合基因工程的安全要求。带有控制带有控制大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）合合成的基因。成的基因。（2）Col质粒：质粒：大肠杆菌素对不带大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或质粒或R质粒如果带有转移基因，质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。也可以成为接合型质粒。非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。但如果在其寄主细胞所需要的基因，因而不能够自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转

15、移中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做程，叫做质粒的迁移作用（质粒的迁移作用（mobilization）。）。ColE1是一种可以迁移但是属于非接合型的质粒。需要质是一种可以迁移但是属于非接合型的质粒。需要质粒自己编码的两种基因参与。一个是位于粒自己编码的两种基因参与。一个是位于ColE1 DNA上的特上的特异位点异位点bom；另一个是；另一个是ColE1质粒特有的弥散的基因产物，即质粒特有的弥散的基因产物，即mob基因（基因（mobilization gene）编码

16、的核酸酶。）编码的核酸酶。3 质粒质粒DNA的迁移作用的迁移作用相容性的两种质粒相容性的两种质粒F和和ColE1共存于同一细菌细胞中，共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为质粒可以为ColE1质粒质粒提供其所缺乏的结合功能，这样使得提供其所缺乏的结合功能，这样使得ColE1质粒也能够发生转移作用。质粒也能够发生转移作用。（a）表示位于）表示位于F-细胞中的细胞中的ColE1质粒的状，它的质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物基因进行了转录，其产物使使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构便从超盘旋的的结构转变成为缺口环状的构

17、型。但转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合配对，所以它的配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复，够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复，所以就出现这两种构型之间的平衡状态。所以就出现这两种构型之间的平衡状态。（b）中的细胞同时含有）中的细胞同时含有F和和ColE1两种质粒。两种质粒。F因子能够导致性须的合成，为因子能够导致性须的合成，为其其DNA转移提供了转

18、移装置，因此转移提供了转移装置，因此ColE1可以被转移。而在可以被转移。而在F质粒提供的这种质粒提供的这种转移装置被分离掉的情况下，转移装置被分离掉的情况下，ColE1的的mob-突变体便不能够转移。遗传分析证突变体便不能够转移。遗传分析证明，明，mob-突变是隐性的，突变是隐性的，mob基因编码一种蛋白质。而且当这种突变体质粒基因编码一种蛋白质。而且当这种突变体质粒被分离出来时，并不是以松弛复合物的形式存在。被分离出来时，并不是以松弛复合物的形式存在。（c）所示，）所示，F质粒无力帮助质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽性须和转移装置虽已形成，但已

19、形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。并没有发生缺口。（d）表示另一种具）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺突变体，它缺失了失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不能蛋白质，但由于不能发生缺口，因此仍然不能够转移。发生缺口，因此仍然不能够转移。4 质粒质粒DNA的复制类型的复制类型1.低拷贝数的质粒低拷贝数的质粒拷贝数少拷贝数少，只有，只有13份拷贝，也称为份拷贝，也称为“严紧型严紧型”复制控制的质粒（复制控制的质粒（stringent plasmid）2.高

20、拷贝的质粒高拷贝的质粒拷贝数多拷贝数多，有，有1060份拷贝，也称为份拷贝，也称为“松弛型松弛型”复制控制的质粒（复制控制的质粒（relaxed plasmid）（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，将质粒分为低拷贝数的质根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，将质粒分为低拷贝数的质粒和高拷贝数的质粒粒和高拷贝数的质粒质粒拷贝数：每条细菌染色体所平均具有的质粒质粒拷贝数：每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子数目。分子数目。质粒的结合转移能力，同它们的分子大小及复制类型质粒的结合转移能力，同它们的分子大小及复制类型间存在一定的

21、相关性。间存在一定的相关性。接合型质粒，分子量大，一般属严紧型接合型质粒，分子量大，一般属严紧型非接合型质粒分子量小，一般属松弛型非接合型质粒分子量小，一般属松弛型（1）质粒的不亲和性现象）质粒的不亲和性现象所谓质粒的不亲和性（所谓质粒的不亲和性（plasmid incompatibility），有时也称），有时也称为为不相容性不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排的现象。在细胞的增殖过

22、程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒不亲和群（不亲和群（incompatibility group），指具有亲缘关系，），指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。但彼此之间是互不相容的质粒。5 质粒的不亲和性质粒的不亲和性（2）质粒不亲和性的分子基础）质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。之间的相互干扰造成的。大多数质粒都会产生出一种大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度

23、是与质粒的拷贝数成正比的。阻遏蛋白质通过同其靶其浓度是与质粒的拷贝数成正比的。阻遏蛋白质通过同其靶序列间的相互作用，使双链序列间的相互作用，使双链DNA中的一条链断裂，从而导致中的一条链断裂，从而导致质粒质粒DNA复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环（馈环（negative feedback loop）。当质粒面临高拷贝数和高）。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白质时，其复制活动便被抑制；而当质粒处于浓度的阻遏蛋白质时，其复制活动便被抑制；而当质粒处于低拷贝和低浓度遏蛋白质的条件下，它的复制反应便会继续低拷贝和低浓度遏蛋白质的条件下，它

24、的复制反应便会继续进行。进行。由于每一种质粒的复制速率和拷贝数控制，都是由一对由于每一种质粒的复制速率和拷贝数控制，都是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。正常拷贝数减少许多。同一细胞中含有两同一细胞中含有两种不相容的质粒，种不相容的质粒，其产生的阻遏蛋白其产生的阻遏蛋白质不仅调节自身的质不仅调节自身的复制，也会调节另复制，也会调节另一种与之共存的不一种与之共存的不相容质粒的复制相容质粒的复制一质粒

25、一质粒DNA复制的多样性复制的多样性不同质粒不同质粒DNA的复制在如下几个方面存多样性：的复制在如下几个方面存多样性：（i）对寄生酶的依赖性）对寄生酶的依赖性 有的完全利用寄主细胞所提供的核酸酶，有的自身也编码若干核酸酶，参有的完全利用寄主细胞所提供的核酸酶，有的自身也编码若干核酸酶，参加加DNA复制复制（ii）DNA聚合酶的利用聚合酶的利用 多数利用多数利用polIII,有的质粒利用有的质粒利用polI（iii）复制的方向性）复制的方向性 有纯单向的，纯双向的，有既有单向又又双向的有纯单向的，纯双向的，有既有单向又又双向的（iv）复制的终止）复制的终止 单向复制，在起点处终止复制单向复制，在

26、起点处终止复制 双向复制，在复制叉到达同一位点时终止，或有一固定的双向复制，在复制叉到达同一位点时终止，或有一固定的终止位点终止位点（v）复制型）复制型 蝶状复制蝶状复制第二节第二节 质粒质粒DNA的复制与拷贝数的控制的复制与拷贝数的控制ColE1质粒质粒DNA的复制，是从一个的复制，是从一个特定的复制起点（特定的复制起点（ori）开始，开始，并沿着环并沿着环DNA分子分子单向性地单向性地进行。进行。控制此种质粒控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素复制启动的两种关键因素RNAI和和RNA两两种种RNA分子，都是由分子，都是由ColE1 DNA转录产生的。转录产生的。RNA也叫做复制引物。也

27、叫做复制引物。RNA分子在转录起点附近同互补分子在转录起点附近同互补的模板的模板DNA形成一种杂交分子，被形成一种杂交分子，被RnaseH酶所切割，从而释酶所切割，从而释放出放出3-OH末端，作为供末端，作为供DNA聚合酶聚合酶合成合成DNA的引物。的引物。RNA可以通过同可以通过同RNA结合，以阻止其与模板结合，以阻止其与模板DNA发生杂发生杂交作用。交作用。从本质上讲，从本质上讲，ColE1质粒的复制启动显然是受一种质粒的复制启动显然是受一种负反馈机理负反馈机理控制的。根据这种模型，细胞中控制的。根据这种模型，细胞中RNA分子的浓度是随着质粒分子的浓度是随着质粒拷贝数的多寡而增减的。例如，

28、若细胞中质粒拷贝数下降到正拷贝数的多寡而增减的。例如，若细胞中质粒拷贝数下降到正常数值以下的水平，常数值以下的水平，RNA的浓度也就相应降低，于是质粒的的浓度也就相应降低，于是质粒的复制也就受到较少的抑制，结果导致其拷贝数的上升。复制也就受到较少的抑制，结果导致其拷贝数的上升。二二ColE1质粒质粒DNA复制的启动复制的启动三质粒复制控制的分子模型三质粒复制控制的分子模型质粒质粒DNA复制控制机理的分子模型有两种复制控制机理的分子模型有两种：自体阻遏蛋白质模型（自体阻遏蛋白质模型（autorepressor model）：）：阻遏蛋白质的合成受负反馈（negative feedback）机理调

29、节，而且其浓度是恒定的。抑制蛋白质稀释模型（抑制蛋白质稀释模型（inhibitor dilution model）：）：阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。（1）抑制蛋白质稀释模型）抑制蛋白质稀释模型质粒质粒DNA编码的抑制蛋白质编码的抑制蛋白质同质粒DNA的复制起点（oir）结合阻断起始蛋白质阻断起始蛋白质Rep的合成的合成细胞中细胞中Cop蛋白质的浓蛋白质的浓度是同质粒分子的拷度是同质粒分子的拷贝数成正比，它抑制贝数成正比，它抑制质粒质粒DNA复制活性的复制活性的作用方式有两种途径作用方式有两种途径1.质粒质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋白质的复制是由一种叫做起始蛋白质R

30、ep引发的引发的pRep蛋白质编码基因蛋白质编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个是属于同一个操纵子，它们共转录成同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。分子。p自体阻遏蛋白质通过同启动子自体阻遏蛋白质通过同启动子-操纵基因区（操纵基因区（P/O）的结合作用，调）的结合作用，调节质粒节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中的转录作用，以维持细胞中Atr和和Rep蛋白质处于恒定的蛋白质处于恒定的水平。水平。p由由Atr蛋白质调节产生的蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的）的结合，来引发质粒结合，来引发

31、质粒DNA的复制的复制2.Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质p既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合而抑制转录作用区结合而抑制转录作用p又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点（又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点（ori）发生作用，引发质）发生作用，引发质粒粒DNA进行复制进行复制（2）自体阻遏蛋白质模型）自体阻遏蛋白质模型第三节 质粒DNA的分离与纯化 应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是要获得应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是要获得批量的纯化的质粒批量的纯化的质粒DNA分子。分子。通常是加入溶

32、菌酶或十二烷基硫酸钠（通常是加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌）来促使大肠杆菌细胞裂解的，绝大部分的染色体细胞裂解的，绝大部分的染色体DNA分子都将以高分子量的分子都将以高分子量的形式释放出来，这样便可以应用高速离心的方法使之与细胞碎形式释放出来，这样便可以应用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到了比较清亮的裂解液。片一起被沉淀除去，得到了比较清亮的裂解液。一氯化铯密度梯度离心法在细胞裂解及DNA分离的过程上，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就

33、是根据这一差别建立的纯化质粒DNA的经典技术。当将含有溴化乙锭（EtBr）的氯化铯（CsCl）溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，EtBr扁平分子便会通过在碱基对之间的嵌入作用而结合成DNA分子链上，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，例如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合相当大量的EtBr分子。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子，EtBr分子的结合数量相对较少。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。线性的或开环的线性的或

34、开环的DNA分子分子，可结合相当大量的可结合相当大量的EtBr分子，分子，密度低密度低共价闭合环状的质粒共价闭合环状的质粒DNA（cccDNA）分子，）分子，EtBr分子分子的结合数量相对较少，的结合数量相对较少，密度高密度高通过氯化铯密度梯度离心，根通过氯化铯密度梯度离心，根据它们的不同密度，就会平衡据它们的不同密度，就会平衡在不同的位置，从而达到纯化在不同的位置，从而达到纯化质粒质粒DNA的目的的目的。根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体与线性染色体DNA片段之间，在拓扑学上的片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。差异而发展出来的。通过加热，在通过加热，在pH值介于

35、值介于12.012.5这个狭窄的范围内，连接这个狭窄的范围内，连接DNA互补链之互补链之间的氢键会被断裂，但由于间的氢键会被断裂，但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性pH值更会迅速地复值更会迅速地复性，复性迅速而准确。性，复性迅速而准确。线性的染色体线性的染色体DNA分子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的分子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离复性作用就不会那么迅

36、速而准确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及便会与变性的蛋白质及RNA一道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒一道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒cccDNA则可用酒精沉淀法收集。则可用酒精沉淀法收集。二碱变性法二碱变性法微量碱变性法具有简单快速、经济实惠的优点，是当前分子生物学及基因工程研究工作中最常用的一种分离纯化质粒DNA的方法第一步，取第一步，取1.5毫升含有质粒的大肠杆菌过夜培养物加在微量离心管中，离心毫升含有质粒的大肠杆菌过夜培养物加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀，并用收集细胞沉淀，并用100微升冰冷的微升冰冷的溶液溶液I50mM葡萄糖，葡萄糖，25Mm T

37、ris-HCl（Ph8.0），），10Mm EDTA，45mg溶菌酶溶菌酶/mL重新悬浮。将反应混合物在室重新悬浮。将反应混合物在室温下静置温下静置5分钟，让溶菌酶充分发挥效力，促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于分钟，让溶菌酶充分发挥效力，促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。溶菌酶对反应液的裂解。溶菌酶对反应液的pH值有很大的依赖关系，值有很大的依赖关系，TrisHCl缓冲体系和适量缓冲体系和适量的葡萄糖而有利于的葡萄糖而有利于pH的调节。乙二胺四乙酸（的调节。乙二胺四乙酸（EDTA），可抑制酸酶的活性，），可抑制酸酶的活性，从而保护质粒从而保护质粒DNA免被降解。免被降解。第二步，加入第二步，加

38、入200微升冰冷的微升冰冷的溶液溶液0.2N NaOH,1.0%SDS，缓缓混匀后，置，缓缓混匀后，置室温下室温下5分钟。分钟。SDS的作用在于使细胞裂解，以释放质粒及染色体的的作用在于使细胞裂解，以释放质粒及染色体的DNA。在。在高高pH值（值（12.012.5）的反应体系中，则会使线性缺口的质粒）的反应体系中，则会使线性缺口的质粒DNA以及线性的以及线性的染色体染色体DNA片段被选择性地变性，而共价闭合环状的质粒片段被选择性地变性，而共价闭合环状的质粒DNA则不会受影响。则不会受影响。三微量碱变性法三微量碱变性法第三步，加入第三步，加入150微升冰冷的微升冰冷的pH4.8的的3M醋酸钠醋酸

39、钠，缓缓震荡，缓缓震荡10秒钟后，放置在秒钟后，放置在冰浴中冰浴中5分钟。分钟。PH4.8的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作值，起到中和作用，从而使线性的质粒及染色体用，从而使线性的质粒及染色体DNA复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的复合物和高分子量的RNA分子发生分子发生沉淀。通过离心处理，便可把网络状的沉淀。通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质聚合物同变性的蛋白质-DNA及及RNA等以复合物形式沉淀

40、出来，从而使质粒等以复合物形式沉淀出来，从而使质粒DNA得到纯化。得到纯化。第四步，将上述离心所得的主要是含有质粒第四步，将上述离心所得的主要是含有质粒cccDNA上的清液，用苯酚抽提上的清液，用苯酚抽提数次除去蛋白质污染物，最后按酒精沉淀法收集质粒数次除去蛋白质污染物，最后按酒精沉淀法收集质粒DNA。按照这种方法制备的质粒按照这种方法制备的质粒DNA，其纯度完全可以满足常规的基因克隆实验要，其纯度完全可以满足常规的基因克隆实验要求。如有必要亦可用凝胶过滤法作进一步的纯化。求。如有必要亦可用凝胶过滤法作进一步的纯化。（1）寄主菌株的遗传背景）寄主菌株的遗传背景大肠杆菌寄主菌株的正确选择，是获得

41、高产量质粒大肠杆菌寄主菌株的正确选择，是获得高产量质粒DNA的的重要条件之下。重要条件之下。建议使用建议使用endA基因发生突变的（基因发生突变的（endA1）大肠杆菌寄主菌株，例）大肠杆菌寄主菌株，例如如DH5、JM109以及以及XL1-Blue等。等。EndA基因突变的结果，使大基因突变的结果，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，的能力，从而增进了所含有的质粒从而增进了所含有的质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主分子的稳定性。所以从这类寄主细胞中制备的质粒细胞中制备的质粒DNA不仅在质量上有所改进，同时在产量上不仅

42、在质量上有所改进，同时在产量上也得到了提高。也得到了提高。四影响质粒四影响质粒DNA产量的因素产量的因素（2）质粒的拷贝数及分子大小）质粒的拷贝数及分子大小细菌培养物中质粒细菌培养物中质粒DNA之理论产量，可以根据公布的质粒的拷之理论产量，可以根据公布的质粒的拷贝数和分子量大小（贝数和分子量大小（bp）及每毫升培养物中的大肠杆菌细胞总数三）及每毫升培养物中的大肠杆菌细胞总数三者相乘得出者相乘得出。质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其DNA产量的重要因产量的重要因素之一。素之一。（1）分子量大，拷贝数低）分子量大，拷贝数低第四节第四节 质粒载体的构

43、建质粒载体的构建1.天然质粒的局限性天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长，分子长 9.1 kb。但只有一个但只有一个EcoR I切点充当克隆位切点充当克隆位点，点，Tetr 作为筛选标志。作为筛选标志。天然质粒天然质粒,是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒造的质粒。在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有有ColE1RSF2124和和pSC101等。等。ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（coli

44、cin E1）。）。（2）筛选标志不理想）筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。但细菌群体容可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗易自发突变出抗colicin E1的细胞的细胞.colicin E1能杀死不含能杀死不含ColE1 质粒的菌，质粒的菌，形成形成“噬菌斑噬菌斑”。唯一的克隆位点唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个正好位于这个基因的内部。基因的内部。ColE1（1）具有复制起点（具有复制起点（ORI）2.质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件（2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点：）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的

45、标志。理想的载体应该有两是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。种抗菌素抗性基因。用来插入外源用来插入外源DNA片断。且插入后不影片断。且插入后不影响复制功能。响复制功能。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。）具有较小的分子量和较高的拷贝数。氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr）四环素抗性四环素抗性 （Tetr）链霉素抗性链霉素抗性 （Strr）氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmlr）3.质粒的选择标记及其工作原理：质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记）选择标记绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：在基

46、因克隆中采用的质粒载体的选择记号，包括在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号，包括有新陈代谢特有新陈代谢特性、对大肠杆菌素性、对大肠杆菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性的免疫性，以及抗菌素抗性等多种。等多种。i）氨苄青霉素（）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。青霉素的衍生物。通过干扰细菌细胞壁合成的末端反通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死应，杀死生长的细菌生长的细菌。a）抑菌原理）抑菌原理b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Ampr基因编码基因编码-内酰胺酶内酰胺酶，特异地，特异地切割氨苄青霉素的切割氨苄青霉素的-内酰胺环。内酰胺环。通过与通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞

47、核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死死。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Cmlr 编码编码乙酰转移酶乙酰转移酶，特异地使氯霉，特异地使氯霉素乙酰化而失活。素乙酰化而失活。a）抑菌原理）抑菌原理a）杀菌原理）杀菌原理通过与通过与70S核糖体结合，导致核糖体结合，导致mRNA发生错读。发生错读。杀死细菌杀死细菌。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Kanr 编码的编码的氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶，对，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。合作用。a）杀菌原理）杀菌原理通过与通过与30S核糖体亚基结合，导

48、致核糖体亚基结合，导致mRNA错译。错译。杀死细菌杀死细菌。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Strr 编码一种编码一种氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶对链对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚亚基结合作用。基结合作用。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理a）抑菌原理）抑菌原理通过于通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死死生长的细菌生长的细菌。Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细

49、菌细胞内。入细菌细胞内。使受体菌发生遗传性状的改变的基因。使受体菌发生遗传性状的改变的基因。当带有当带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的的载体载体进入受体菌进入受体菌后，受体菌才能生长。后，受体菌才能生长。不带有不带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的受体菌不能在含的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（2）抗菌素选择原理）抗菌素选择原理活活死死抗性基因抗性基因抗菌素抗菌素（1）高拷贝数的质粒载体）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。派生质粒具有高拷贝数的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下而且在没有菌体蛋白质合成

50、的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数数1000100030003000个！个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。（2）低拷贝数的质粒载体）低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途但有特殊用途:由由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就