发酵工程第二章-发酵工业菌种的选育课件.ppt

1、微生物工程工业生产微生物工程工业生产水平的三个决定要素水平的三个决定要素:生产菌种的性能生产菌种的性能生产设备生产设备发酵和提取工艺条件发酵和提取工艺条件优良的优良的生产菌种生产菌种是实现是实现高水平高水平微生物工程工业微生物工程工业生生产产的第一环节。的第一环节。2.1 2.1 发酵工业常用菌种发酵工业常用菌种2.2 2.2 发酵工业菌种的分离筛选发酵工业菌种的分离筛选2.3 2.3 发酵工业菌种鉴定发酵工业菌种鉴定2.4 2.4 发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良2.5 2.5 发酵工业菌种保藏发酵工业菌种保藏2.1.1 微生物的特性微生物的特性q 有些微生物能在有些微生物能在厌氧厌氧的条件

2、下生长的条件下生长q 有些微生物能够利用有些微生物能够利用简单的有机简单的有机 物物和和无机物无机物满足自身的生长满足自身的生长q 有些微生物能进行有些微生物能进行复杂的代谢复杂的代谢q 有些微生物能利用较有些微生物能利用较复杂的化合物复杂的化合物q 有些微生物能在有些微生物能在极端的环境极端的环境下生长下生长2.12.1发酵工业常用菌种发酵工业常用菌种2.1.3 已工业化菌种已工业化菌种（一）（一）细菌细菌单细胞的原核微生物，环状单细胞的原核微生物，环状DNA，二分分裂方式繁殖，在，二分分裂方式繁殖，在自然界分布最广，数量最多自然界分布最广，数量最多。1 1、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌 (B

3、acillus Bacillus subtilissubtilis)分布广，常存在于枯草、土壤等，一般为分布广，常存在于枯草、土壤等，一般为腐生菌；腐生菌；革兰氏染色阳性革兰氏染色阳性 能产生大量淀粉酶和蛋白酶，有的菌株具能产生大量淀粉酶和蛋白酶，有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。有强烈降解核苷酸的酶系。AS1.393 AS1.393 蛋白酶蛋白酶 BF7658 BF7658 -淀粉酶淀粉酶 在酱油、酱类和白酒制曲时，如果水分含量在酱油、酱类和白酒制曲时，如果水分含量大，温度较高，就容易造成枯草杆菌迅速繁大，温度较高，就容易造成枯草杆菌迅速繁殖；不仅消耗原料蛋白质和淀粉，而且生成殖；不仅消耗原

4、料蛋白质和淀粉，而且生成刺眼鼻的氨味，造成曲子发粘发臭，使制曲刺眼鼻的氨味，造成曲子发粘发臭，使制曲失败。失败。2 2、大肠杆菌、大肠杆菌 (Escherichia coliEscherichia coli)可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸的定量分析酸的定量分析 基因工程的很好材料基因工程的很好材料3、乳酸杆菌、乳酸杆菌 (Lactobacillus sp.)革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧 可生产乳酸可生产乳酸

5、 干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作4 4、丙酮丁醇梭菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutyleumClostridium acetobutyleum)芽孢卵形，中生或次端生，使芽孢囊膨大成梭状芽孢卵形，中生或次端生，使芽孢囊膨大成梭状或鼓槌形或鼓槌形 专性厌氧，革兰氏染色阳性专性厌氧，革兰氏染色阳性 发酵生产丙酮丁醇发酵生产丙酮丁醇5 5、醋酸杆菌、醋酸杆菌 (AcetobacterAcetobacter)不形成芽孢，不形成芽孢，G G，好气性，好气性 可生产醋酸可生产醋酸 分两群：分两群：1 1）只将乙醇氧化成醋酸）只将乙醇氧

6、化成醋酸 2 2）将产生的醋酸继续氧化成）将产生的醋酸继续氧化成COCO2 2和水和水 6 6、棒状杆菌、棒状杆菌 (Corynebacterium)(Corynebacterium)以葡萄糖为原料发酵产生酸，是谷氨酸和其他氨基酸以葡萄糖为原料发酵产生酸，是谷氨酸和其他氨基酸 的高产菌的高产菌 如北京棒杆菌如北京棒杆菌AS1.299AS1.299、钝齿棒杆菌、钝齿棒杆菌AS1.542AS1.5427 7、短杆菌、短杆菌 (Brevibacterium)(Brevibacterium)氨基酸、核苷酸氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶工业生产中常用的菌种，也是酶法合成法合成生产辅酶生产辅酶

7、A A的菌种的菌种 8、肠膜状明串珠菌、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)G G+、微需氧至兼性厌氧，生长需要缬氨酸和谷氨酸、微需氧至兼性厌氧，生长需要缬氨酸和谷氨酸 在蔗糖液中形成特征性葡聚糖黏液（在蔗糖液中形成特征性葡聚糖黏液（20-25C20-25C促使形成）促使形成）可生产葡聚糖可生产葡聚糖 使糖汁变粘而无法加工，为糖厂有害菌使糖汁变粘而无法加工，为糖厂有害菌9 9、黄单胞菌、黄单胞菌 (Xanthomonas)(Xanthomonas)细胞直杆状，细胞直杆状，G G，无芽孢，极生鞭毛，无芽孢，极生鞭毛 在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、边缘整齐、粘稠光滑

8、的黄在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、边缘整齐、粘稠光滑的黄色菌落；液体培养形成黄色粘稠的胶状物色菌落；液体培养形成黄色粘稠的胶状物荚膜多糖，其黄荚膜多糖，其黄色为一种水溶性色素色为一种水溶性色素 野油菜黄单胞菌野油菜黄单胞菌(X.campestrisX.campestris)可以用淀粉生产黄原胶可以用淀粉生产黄原胶1010、假单胞菌、假单胞菌 (Pseudomonas)(Pseudomonas)G G-细菌，能发酵生产维生素细菌，能发酵生产维生素B12B12、丙氨酸、谷氨酸、葡、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化；萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化；

9、有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。（二）（二）放线菌放线菌 菌落呈放射状，原核微生物菌落呈放射状，原核微生物类群，在自然界中分布很广，类群，在自然界中分布很广，尤其在有机质丰富的微碱性土尤其在有机质丰富的微碱性土壤中较多。壤中较多。大多腐生，少数寄生。大多腐生，少数寄生。产生多种抗生素（产生多种抗生素（12 00012 000余种，余种，60%60%左右来自放线菌），经济价左右来自放线菌），经济价值大。革兰氏阳性、高值大。革兰氏阳性、高(G+C)(G+C)mol%mol%含量含量(55%)(55%)一些种类的放线菌还能产生各种一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂

10、酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维素酶等）、维生素维生素（B12B12）和）和有机酸有机酸等。等。弗兰克菌属（弗兰克菌属（FrankiaFrankia）为）为非豆科木本植物非豆科木本植物根瘤中有根瘤中有固氮能力的内固氮能力的内共生菌。共生菌。放线菌还可用于放线菌还可用于甾体转化甾体转化、烃类发酵烃类发酵、石油脱蜡石油脱蜡和和污水处理污水处理等方等方面。面。1 1、链霉菌属、链霉菌属 (Streptomyces Streptomyces)灰色链霉菌灰色链霉菌(Streptomyces griseusStreptomyces griseus)生产生产链霉素链霉素金霉素

11、链霉菌金霉素链霉菌 (Streptomyces aureofaciensStreptomyces aureofaciens)生产生产金霉素金霉素红霉素链霉菌红霉素链霉菌 (Streptomyces erythreusStreptomyces erythreus)生产生产红霉素红霉素龟裂链霉菌龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosusStreptomyces rimosus)菌落灰白色，表面后期有皱折，呈龟裂状菌落灰白色，表面后期有皱折，呈龟裂状 生产生产土霉素土霉素2 2、小单胞菌属、小单胞菌属 (MicromonosporaMicromonospora)与一般放线菌不同，菌丝体长

12、入与一般放线菌不同，菌丝体长入培养基内，不形成气生菌丝，而在培养基内，不形成气生菌丝，而在基内菌丝体上长出孢子梗，其顶端基内菌丝体上长出孢子梗，其顶端生一个球形、椭圆形孢子。生一个球形、椭圆形孢子。菌落致密，与培养基紧密结合在菌落致密，与培养基紧密结合在一起，表面凸起，多崎岖，疣状；一起，表面凸起，多崎岖，疣状；菌落常为橙黄色、红色、深褐色、菌落常为橙黄色、红色、深褐色、黑色和兰色。黑色和兰色。可产多种抗生素，如产庆大霉素可产多种抗生素，如产庆大霉素3 3、游动放线菌属、游动放线菌属 （ActinoplanesActinoplanes）一般不形成气生菌丝，孢囊在培养基内菌丝上形一般不形成气生菌

13、丝，孢囊在培养基内菌丝上形成，孢囊孢子在孢囊内盘卷或呈直线排列；孢子球形，成，孢囊孢子在孢囊内盘卷或呈直线排列；孢子球形，有时端生有时端生1-401-40根鞭毛，能运动。根鞭毛，能运动。济南游动放线菌济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesisActinoplanes tsinanesis)产产创新霉素创新霉素(creatmycin;1964)(creatmycin;1964)4 4、诺卡氏菌属、诺卡氏菌属 (NorcadiaNorcadia)一般无气丝，基丝培养十几小时形成横隔，并一般无气丝，基丝培养十几小时形成横隔，并断裂成杆状或球状孢子。断裂成杆状或球状孢子。菌落较小

14、，边缘多呈树根毛状。菌落较小，边缘多呈树根毛状。生产利福霉素、蚊霉素生产利福霉素、蚊霉素 等等5 5、孢囊链霉菌属、孢囊链霉菌属 (StreptosporangiumStreptosporangium)孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢囊孢子，孢囊孢孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢囊孢子，孢囊孢子无鞭毛子无鞭毛产多霉素、创新霉素产多霉素、创新霉素（三）酵母菌（三）酵母菌单细胞真核，主分布单细胞真核，主分布于含糖质较多的偏酸于含糖质较多的偏酸性环境中，如水果、性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤子上，以及果园土壤中。中。1 1、啤酒酵母、啤酒酵母 (Saccharo

15、myces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae)根据长与宽的比例，分三组：根据长与宽的比例，分三组：第一组第一组 长宽比为长宽比为12 细胞多为圆形、卵圆形；细胞多为圆形、卵圆形；主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包第二组第二组 长宽比为长宽比为2 多供生产葡萄酒、果酒用多供生产葡萄酒、果酒用第三组第三组 长宽比大于长宽比大于2 耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类：啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类：上面酵母上面酵母发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面发酵

16、度较高，不易凝集沉淀，浮于上面下面酵母下面酵母发酵度较低，易凝集沉淀发酵度较低，易凝集沉淀 啤酒酵母的应用非常广，常用于传统的发酵行啤酒酵母的应用非常广，常用于传统的发酵行业，如啤酒、白酒、果酒、酒精、药用酵母、面包业，如啤酒、白酒、果酒、酒精、药用酵母、面包制作，故又称酿酒酵母。制作，故又称酿酒酵母。近年来，利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、近年来，利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、细胞色素细胞色素C C、凝血质和辅酶、凝血质和辅酶A A等；生产单细胞蛋白等；生产单细胞蛋白(SCP)(SCP)、药用和作为饲料；它的转化酶可用于转、药用和作为饲料；它的转化酶可用于转化蔗糖，制造酒心巧克力。化蔗糖，

17、制造酒心巧克力。2 2、葡萄汁酵母、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)(Saccharomyces uvarum)与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵母能发酵棉子糖棉子糖和和蜜二糖蜜二糖 葡萄汁酵母常用于啤酒酿造的底层发酵，葡萄汁酵母常用于啤酒酿造的底层发酵，也可食用、药用或作饲料。也可食用、药用或作饲料。3 3、汉逊酵母、汉逊酵母 (HansenulaHansenula)此属酵母多能产生此属酵母多能产生乙酸乙酯乙酸乙酯，从而增加，从而增加产品的香味，可用于酿酒和食品工业。产品的香味，可用于酿酒和食品工业。但由于它能利用酒精

18、作碳源，又能在饮但由于它能利用酒精作碳源，又能在饮料表面产生干皱的菌膜，所以又是酒精生产料表面产生干皱的菌膜，所以又是酒精生产的有害菌。的有害菌。能形成假丝，液体培养时能形成浮膜能形成假丝，液体培养时能形成浮膜 可生产可生产SCP、甘油、脂肪酶、甘油、脂肪酶4 4、球拟酵母、球拟酵母 (ToruiopsisToruiopsis)有些种能产生不同比例的甘油、赤藓糖、阿拉有些种能产生不同比例的甘油、赤藓糖、阿拉伯糖；伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。有的能利用烃类生产蛋白质。5 5、假丝酵母、假丝酵母 (CandidaCandida)6 6、红酵母、红酵母 (RhodotorulaRhodotoru

19、la)有明显的红色或黄色色素，很多种因生有明显的红色或黄色色素，很多种因生荚膜而形成粘质状菌落荚膜而形成粘质状菌落 可由菌体提取大量脂肪、可由菌体提取大量脂肪、-胡萝卜素胡萝卜素7 7、棉病针孢酵母、棉病针孢酵母 (Nematspora gossypii Nematspora gossypii)又名棉病囊霉，能危害许多重要的经济作又名棉病囊霉，能危害许多重要的经济作物，如棉花、柑橘、番茄等物，如棉花、柑橘、番茄等 该菌具有大量合成核黄素的能力，是该菌具有大量合成核黄素的能力，是核黄核黄素素生产的重要菌种生产的重要菌种 8 8、毕赤氏酵母、毕赤氏酵母 (Pichia Pichia)能利用石油或农

20、副产品及工业废料产生能利用石油或农副产品及工业废料产生菌体蛋白菌体蛋白，有些菌株能生产麦角固醇、苹果，有些菌株能生产麦角固醇、苹果酸、磷酸甘露聚糖酸、磷酸甘露聚糖 近年来其在基因工程中的作用日益得到近年来其在基因工程中的作用日益得到重视重视（四）霉菌（四）霉菌1 1、根霉、根霉 (RhizopusRhizopus)米根霉米根霉 (Rhizopus oryzaeRhizopus oryzae)淀粉酶活力极强，多作糖淀粉酶活力极强，多作糖化酶使用；又由于具有较强的化酶使用；又由于具有较强的蛋白质分解能力，也可用于制蛋白质分解能力，也可用于制作腐乳。作腐乳。华根霉华根霉 (Rhizopus chin

21、entisRhizopus chinentis)是酿酒所必须的重要霉菌，也是酿酒所必须的重要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要是酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌种。菌种。2 2、毛霉、毛霉 (Mucor Mucor)鲁氏毛霉鲁氏毛霉 (Mucor rouxianus)(Mucor rouxianus)从我国小曲中分离出来；从我国小曲中分离出来；能糖化淀粉且能生成少量酒精；能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生蛋白酶，有分解大豆蛋白能产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，常用来制作腐乳的能力，常用来制作腐乳总状毛霉总状毛霉 (Mucor racemosus)(Mucor racemosus)是毛霉中分

22、布最广的一种，几乎是毛霉中分布最广的一种，几乎在各地土壤中、一些生霉的材料上、空气中都在各地土壤中、一些生霉的材料上、空气中都能找到；酒曲中常见能找到；酒曲中常见 可制作豆豉可制作豆豉3 3、曲霉、曲霉 (Aspergillus Aspergillus)米曲霉米曲霉 (Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae)有较强的蛋白分解能力，同时又具有有较强的蛋白分解能力，同时又具有糖化能力糖化能力 酿酒中的糖化菌；蛋白酶和淀粉酶的酿酒中的糖化菌；蛋白酶和淀粉酶的生产菌生产菌黑曲霉黑曲霉 (Aspergillus nigerAspergillus niger)具有多种强大

23、的酶系，如淀粉酶、蛋具有多种强大的酶系，如淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和葡萄糖氧化白酶、果胶酶、纤维素酶和葡萄糖氧化酶等；酶等；还能产生多种有机酸，如抗坏血酸、还能产生多种有机酸，如抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸和没食子酸等柠檬酸、葡萄糖酸和没食子酸等是生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种是生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种4 4、青霉、青霉 (Penicillum Penicillum)产黄青霉产黄青霉 (Penicillum chrysogenumPenicillum chrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸化酶、葡萄糖

24、酸、柠檬酸和抗坏血酸娄地青霉娄地青霉 (Penicillum roquefortiPenicillum roqueforti)属不对称青霉，具有分解油脂和蛋白属不对称青霉，具有分解油脂和蛋白质的能力，可用于制造干酪；该菌孢子能质的能力，可用于制造干酪；该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基酮将甘油三酯氧化为甲基酮展开青霉展开青霉 (P.patulumP.patulum)又名寻麻青霉，主要用于生产灰黄霉素（一种又名寻麻青霉，主要用于生产灰黄霉素（一种有效的可口服抗生素，用于治疗真菌性皮肤病、痢有效的可口服抗生素，用于治疗真菌性皮肤病、痢疾及灰指甲）疾及灰指甲）橘青霉橘青霉 (P.citrinumP.ci

25、trinum)许多菌系可产生橘霉素，也能产生脂肪酶、葡许多菌系可产生橘霉素，也能产生脂肪酶、葡萄糖氧化酶和凝乳酶萄糖氧化酶和凝乳酶 有的菌系产生有的菌系产生5-5-磷酸二酯酶，可用它生产磷酸二酯酶，可用它生产5-5-核苷酸核苷酸 （肌苷酸和鸟苷酸具有很强的助鲜作用）（肌苷酸和鸟苷酸具有很强的助鲜作用）5 5、白地霉、白地霉 (Geotrichum candidum Geotrichum candidum)节孢子单个或连接成链节孢子单个或连接成链 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很料用，也可用来提取核酸，在

26、废料废水的利用上很用价值用价值6 6、产黄头孢霉、产黄头孢霉 (Cephalosporium Cephalosporium chrysogen chrysogen)营养菌丝分隔；营养菌丝分隔；分生孢子梗短，大多从分生孢子梗短，大多从气丝上生出；气丝上生出；分生孢子从顶端长出后分生孢子从顶端长出后推至侧旁，靠黏液连成推至侧旁，靠黏液连成假头状，遇水散开假头状，遇水散开头孢霉素、先锋霉素头孢霉素、先锋霉素放线菌（链霉素放线菌（链霉素四环素；红霉素四环素；红霉素等）等）真菌（青霉素、头孢等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌一些产芽孢的细菌植物或动物来源植物或动物来源抗生素生产有关的微生物抗生素

27、生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：目前发现的生物来源如下：氨基酸生产有关的微生物氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,6050,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵

28、工业发展历史上的一个转折点：发酵工业发展历史上的一个转折点：氨基酸生产菌的要求：氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌草芽孢杆菌食品酶制剂生产有关的微生物食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列毒理试验研究。关于食开发一个新酶，都要经过一

29、系列毒理试验研究。关于食品用酶，美国需要得到品用酶，美国需要得到FDAFDA的批准。目前已同意使用的仅的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌常用的基因表达系统常用的基因表达系统原核生物原核生物：大肠杆菌：大肠杆菌(1977(1977年年Boyer)Boyer)、枯草牙胞杆菌、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌沙门氏菌 生长迅速、蛋白产量高生长迅速、蛋白产量高;表达蛋白的纯化、分离及分析快速；表达蛋白的纯化、分离及分析快速；外源基因的导入相

30、对容易；外源基因的导入相对容易；已建立了整套表达理论及技术。已建立了整套表达理论及技术。真核细胞表达系统真核细胞表达系统 酵母酵母 生长迅速，营养要求不高，易培养；生长迅速，营养要求不高，易培养；安全性好；安全性好；比哺乳动物细胞操作简单；比哺乳动物细胞操作简单；具有一定的修饰蛋白的能力。具有一定的修饰蛋白的能力。2.22.2发酵工业菌种的分离筛选发酵工业菌种的分离筛选菌种分离菌种分离 将混杂着各种微生物的样品按需要和菌株的特性将混杂着各种微生物的样品按需要和菌株的特性迅速、准确、有效的方法对其进行分离、筛选，得到所需微迅速、准确、有效的方法对其进行分离、筛选，得到所需微生物的过程。生物的过程

31、。菌种分离方法菌种分离方法 依据生产需要、目的代谢产物性质、可能依据生产需要、目的代谢产物性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物分布、理化特性、产生所需目的产物的微生物种类、微生物分布、理化特性、生活环境等，设计选生活环境等，设计选择性高择性高的分离方法。的分离方法。菌种筛选方法菌种筛选方法 选择性强和灵敏度高选择性强和灵敏度高，专一性的检测方法专一性的检测方法。如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题：样品

32、采集样品采集 预处理预处理 富集培养富集培养 菌种初筛菌种初筛 菌种复筛菌种复筛 菌种发酵性能鉴定菌种发酵性能鉴定 菌种保藏菌种保藏菌种分离菌种分离的一般过程的一般过程采样原则采样原则l 样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。极样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。极端环境，可能找到适应此环境的微生物。端环境，可能找到适应此环境的微生物。l 了解目标产物的性质，可能产目标产物的微生物种了解目标产物的性质，可能产目标产物的微生物种类及其生理特征类及其生理特征2.2.1 样品采集样品采集微生物代谢规律微生物代谢规律 初级代谢产物初级代谢产物 细菌细菌 真菌真菌 次级代谢产物次级代谢产物 丝

33、状菌丝状菌 产芽孢细菌产芽孢细菌 微生物生理特性微生物生理特性 微生物营养（微生物营养（C C、N N需求营养、代谢类型与生长环需求营养、代谢类型与生长环境的相关性）境的相关性）如：森林土壤如：森林土壤 适于利用纤维素为碳源的纤维适于利用纤维素为碳源的纤维素酶产生菌。素酶产生菌。如：肉类加工成、饭店泔水如：肉类加工成、饭店泔水 适于产蛋白酶和适于产蛋白酶和脂肪酶的产生菌。脂肪酶的产生菌。微生物生理特征（与生长环境的相关性）微生物生理特征（与生长环境的相关性）土样样品采集土样样品采集土壤有机质含量和通风状况土壤有机质含量和通风状况土壤酸碱度和植被状况土壤酸碱度和植被状况地理条件地理条件季节条件季

34、节条件 温度适中温度适中 雨量不多雨量不多5-25cml 物理方法物理方法2.2.2 样品预处理样品预处理热处理方法热处理方法 减少样品中的细菌数减少样品中的细菌数 膜过滤法和离心法膜过滤法和离心法 浓缩水中的微生物细胞浓缩水中的微生物细胞 l 化学方法化学方法l 诱饵法诱饵法富集的三种方案：富集的三种方案：定向培养定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的采用特定的有利于目的微生物富集的 方法。包括控制培养基的营养成分、控制培养条方法。包括控制培养基的营养成分、控制培养条件。件。富集的目的：富集的目的：目标微生物在种群中占优势，使筛选变得可能目标微生物在种群中占优势，使筛选变得可能 当不可能

35、采用定向培养时，则可考虑设计一个在当不可能采用定向培养时，则可考虑设计一个在分类学的方法。分类学的方法。不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法。时只能通过随机分离的办法。2.2.3 富集培养富集培养定向培养的富集条件定向培养的富集条件1、底物、底物2、pH条件条件3、培养时间、培养时间4、培养温度、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优连续）后使目的微生物在种群中占优势。势。定向培养的培养基成分定向培养

36、的培养基成分加入相应的底物作为唯一碳源或者氮源，能分解的菌增加加入相应的底物作为唯一碳源或者氮源，能分解的菌增加2.2.4 菌种分离菌种分离（1）平板划线分离法）平板划线分离法（2）稀释分离法）稀释分离法（3）简单平板分离法）简单平板分离法 （4）涂布分离法）涂布分离法（5）毛细管分离法）毛细管分离法（6）小滴分离法）小滴分离法 菌株在牛奶平板上产生的透明水解圈菌株在牛奶平板上产生的透明水解圈(0.5%脱脂牛奶，脱脂牛奶，1.5%琼脂粉琼脂粉)季金殿等季金殿等.一株新的羽毛角蛋白降解菌的分离、鉴定及系统发育分析一株新的羽毛角蛋白降解菌的分离、鉴定及系统发育分析,http:/ 菌株对槐豆胶的降解

37、作用菌株对槐豆胶的降解作用（37,24h）(槐豆胶槐豆胶 2g，琼脂粉，琼脂粉 1.5g，MgCl26H2O 0.02g，K2HPO43H2O 0.1g，KNO3 0.05g，蒸馏水，蒸馏水100mL，pH 7.0-7.2)角蛋白酶活力（微杆菌属）-甘露聚糖酶活力（枯草芽孢杆菌）李李 伟伟.产产-甘露聚糖酶菌株的筛选及产酶条件优化的研究甘露聚糖酶菌株的筛选及产酶条件优化的研究,http:/www.bosar- 初筛初筛（1）平板筛选平板筛选初筛 菌株在淀粉平板上产生的透明水解圈菌株在淀粉平板上产生的透明水解圈(牛肉膏牛肉膏3g、蛋白胨、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉、可溶性淀粉2g溶

38、溶于于1000mL蒸馏水中，再加入蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，琼脂粉，pH调至调至7.2)张张 新新 军军.土壤中淀粉酶产生菌的筛选及其发酵条件研究土壤中淀粉酶产生菌的筛选及其发酵条件研究,http:/ 从产物角度出发从产物角度出发在培养时以产物的形成，有目的的设计培养基在培养时以产物的形成，有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法利用简单、快速的鉴定方法q 从形态的角度从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。菌落外

39、观上就可以初步识别。（2）摇瓶发酵筛选摇瓶发酵筛选2.2.6 复筛复筛采用摇瓶培养，一个菌株重复采用摇瓶培养，一个菌株重复35瓶，培养后的发酵液采瓶，培养后的发酵液采用精确的分析方法测定。用精确的分析方法测定。2.3 2.3 发酵工业菌种鉴定发酵工业菌种鉴定l 菌种鉴定工作菌种鉴定工作 测定一系列必要的鉴定指标测定一系列必要的鉴定指标 查找权威性的鉴定手册，确定菌种类型查找权威性的鉴定手册，确定菌种类型 l 鉴定指标鉴定指标 与微生物的种类有关与微生物的种类有关微生物鉴定的方法：微生物鉴定的方法：经典的分类鉴定方法经典的分类鉴定方法 现代分类鉴定方法现代分类鉴定方法 将菌种直接送到权威鉴定机构

40、鉴定将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定微生物的技术分成四个不同的水平：微生物的技术分成四个不同的水平：细胞的形态和习性水平细胞的形态和习性水平 细胞组分水平细胞组分水平 蛋白质水平蛋白质水平 基因或核酸水平基因或核酸水平 2.3.1 2.3.1 经典的分类鉴定方法经典的分类鉴定方法（1 1）形态学特征）形态学特征（2 2）生理生化特征）生理生化特征 包括菌落特征、细胞形态、细胞大小、细胞排列、特包括菌落特征、细胞形态、细胞大小、细胞排列、特殊的细胞结构、染色反应等。殊的细胞结构、染色反应等。包括营养类型、对氮源的利用能力、对碳源的利用能包括营养类型、对氮源的利用能力、对碳源的利用能力、对生长因子的

41、需要、需氧性；对温度、力、对生长因子的需要、需氧性；对温度、pHpH渗透压的适渗透压的适应性；对抗生素及抑菌剂的敏感性；代谢产物及其与宿主应性；对抗生素及抑菌剂的敏感性；代谢产物及其与宿主的关系等。的关系等。2.3.1 2.3.1 经典的分类鉴定方法经典的分类鉴定方法（3 3）血清学试验与噬菌体分型）血清学试验与噬菌体分型 生物体外进行不同微生物之间抗原与抗体反应试验生物体外进行不同微生物之间抗原与抗体反应试验血清学试验来进行微生物的分类和鉴定。血清学试验来进行微生物的分类和鉴定。使用的方法除了凝集反应外，还有沉淀反应（如凝胶使用的方法除了凝集反应外，还有沉淀反应（如凝胶扩散、免疫电泳）、补体

42、结合、直接或间接的免疫荧光抗扩散、免疫电泳）、补体结合、直接或间接的免疫荧光抗体技术、酶联免疫以及免疫组织化学等方法。通常是对全体技术、酶联免疫以及免疫组织化学等方法。通常是对全细胞或者细胞壁、鞭毛、荚膜或黏液层的抗原性进行分析细胞或者细胞壁、鞭毛、荚膜或黏液层的抗原性进行分析比较。比较。2.3.1 2.3.1 经典的分类鉴定方法经典的分类鉴定方法（4 4）氨基酸顺序和蛋白质分析）氨基酸顺序和蛋白质分析 对某些同源蛋白质氨基酸序列的比较来分析不同生物对某些同源蛋白质氨基酸序列的比较来分析不同生物系统发育的关系，序列相似性越高，其亲缘关系愈近。由系统发育的关系，序列相似性越高，其亲缘关系愈近。由

43、此，可以根据蛋白质的氨基酸序列资料构建系统发育树并此，可以根据蛋白质的氨基酸序列资料构建系统发育树并据此进行系统分类。据此进行系统分类。2.3.2 2.3.2 现代分类鉴定方法现代分类鉴定方法（1 1）微生物遗传型的鉴定微生物遗传型的鉴定 DNA DNA的碱基组成的碱基组成 DNADNA的碱基组成和排列顺序决定着生物的遗传性状，的碱基组成和排列顺序决定着生物的遗传性状，分类学上，用（分类学上，用（G+CG+C）占全部碱基的质量分数（）占全部碱基的质量分数（G+CG+C）来）来表示各类生物的表示各类生物的DNADNA碱基组成特征。碱基组成特征。测定测定DNADNA碱基组成的方法：碱基组成的方法：

44、l 常用的有热变性温度法常用的有热变性温度法l 浮力密度法浮力密度法l 高效液相色谱法。高效液相色谱法。核酸的分子杂交核酸的分子杂交 不同生物不同生物DNADNA碱基排列顺序的异同直接反映这些生物碱基排列顺序的异同直接反映这些生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近。的亲缘关系就越近。采用较为间接的比较方法采用较为间接的比较方法核酸杂交核酸杂交l DNA-DNADNA-DNA杂交杂交l DNA-RNADNA-RNA杂交杂交 遗传重组特性分析遗传重组特性分析 染色体之间存在同源性才能发生遗传重组。染色体之间存在同源性

45、才能发生遗传重组。同源重同源重组还涉及其他因素，因此，不能以同源重组作为唯一的判组还涉及其他因素，因此，不能以同源重组作为唯一的判断标准。断标准。通常具有种属特异性通常具有种属特异性 rRNA rRNA序列分析序列分析 原核生物原核生物16S rRNA16S rRNA和真核生物的和真核生物的18S rRNA18S rRNA的基因序列，的基因序列，根据序列差异计算它们之间的进化距离，画出生物进化树。根据序列差异计算它们之间的进化距离，画出生物进化树。（2 2）细胞化学成分特征分类法）细胞化学成分特征分类法 细胞壁的化学组分及分枝菌酸分析；细胞壁的化学组分及分枝菌酸分析；细胞壁的化学组分比较常用的

46、是红外光谱分析法。每细胞壁的化学组分比较常用的是红外光谱分析法。每种物质都有特定的光谱。这种技术适用于种物质都有特定的光谱。这种技术适用于“属属”的分类。的分类。全细胞水解液的糖型；全细胞水解液的糖型；脂肪酸组成及磷脂成分分析；脂肪酸组成及磷脂成分分析；醌类及多胺类的分析；醌类及多胺类的分析；可溶性蛋白的质谱分析可溶性蛋白的质谱分析（3 3）数值分类法）数值分类法 也叫统计分类法。采用相同的可比特征（形态、生也叫统计分类法。采用相同的可比特征（形态、生理、生化等），根据相似系数比较。理、生化等），根据相似系数比较。2.3.3 2.3.3 将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定将菌种直接送到权威鉴定机构

47、鉴定中国微生物菌种保藏管理委员会（中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCMCCCCM）httphttp：micronetmicronetimimacaccncndatabasedatabaseaboutccccmcaboutccccmchtmlhtml 中国科学院典型培养物保藏委员会（中国科学院典型培养物保藏委员会（CTCCCASCTCCCAS）httphttp：/ 中国典型培养物保藏中心（中国典型培养物保藏中心（CCTCCCCTCC）httphttp：/www.cctcc.org/www.cctcc.org 中国工业微生物菌种保藏管理中心（中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICCCICC）h

48、ttphttp：chinacicc.orgchinacicc.org 2.3.3 2.3.3 将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定将菌种直接送到权威鉴定机构鉴定中国工业微生物菌种保藏管理中心（中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICCCICC）httphttp：chinaciccchinaciccorgorg美国典型培养物保藏中心（美国典型培养物保藏中心（ATCCATCC）httphttp：wwwwwwatccatccorgorg。英国国家典型培养物保藏中心（英国国家典型培养物保藏中心（UKNCCUKNCC）httphttp：wwwwwwuknccuknccCOCOukuk法国巴斯德研究所菌种保藏中心

49、（法国巴斯德研究所菌种保藏中心（CIPCIP）httphttp：cipcippasteurpasteurfrfr德国科赫研究所菌种保藏中心（德国科赫研究所菌种保藏中心（RKIRKI）httphttp：wwwwwwrkirkide de 2.4 2.4 发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良目的l 提高目标产物的产量提高目标产物的产量l 提高目标产物的纯度提高目标产物的纯度l 开发新产品开发新产品l 防止菌种退化防止菌种退化自然选育自然选育诱变育种诱变育种杂交育种杂交育种 原生质体融合育种原生质体融合育种基因工程育种基因工程育种菌种改良方法菌种改良方法自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：一般习惯上将自

50、然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验自然选育虽然突变率很低自然选育虽然突变率很低（10-810-5），），但却是工厂保证稳但却是工厂保证稳产高产的重要措施。产高产的重要措施。2.4.1 2.4.1 自然选育自然选育用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变，进行所要求用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变，进行所要求的变异菌种筛选，称为诱变育种。的变异菌种筛选，称为诱变育种。是最常用的菌种改良手段。是最常用的菌种改良手段。包括包括诱变诱变和和