单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合课件.ppt
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- 单克隆抗体 制备 过程 注射 抗原 淋巴细胞 骨髓瘤 细胞 细胞融合 课件
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1、抗体工程制药抗体工程制药20112011年年6 6月月第一节第一节 概述概述第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体第三节第三节 基因工程抗体基因工程抗体第四节第四节 噬菌体抗体工程噬菌体抗体工程第五节第五节 转基因动物表达抗体转基因动物表达抗体第六节第六节 抗体工程在制药功业上的应用抗体工程在制药功业上的应用第一节第一节 概概 述述一、抗体定义一、抗体定义抗体(抗体(antibody,Ab):):指能与相应抗原指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白(免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig):具有具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白抗
2、体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白IgAb化学结构上的概念化学结构上的概念生物学功能上的概念生物学功能上的概念二、抗体工程发展历程二、抗体工程发展历程1890年,年,Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素和北里柴三郎发现白喉抗毒素1937年,年,Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种(白蛋白、甲种()球蛋白、乙种()球蛋白、乙种()球蛋白、)球蛋白、丙种(丙种()球蛋白,并证明抗体活性主要存在于)球蛋白,并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。丙种球蛋白组分。1975年,年,Khler and Milstein等首次利用等首次利用B淋巴淋巴细胞杂交瘤
3、技术制备出细胞杂交瘤技术制备出 McAb.在临床上主要用于在临床上主要用于诊断和治疗。诊断和治疗。1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 多克隆抗多克隆抗体体单克隆单克隆抗体抗体基因工程基因工程抗体抗体三、抗体分子的结构与功能三、抗体分子的结构与功能1、酶解片段、酶解片段木瓜蛋白酶 (1)Fab(1)Fab段段2 2个个(2)Fc(2)Fc段段 1 1个个 胃蛋白酶 (1)F(ab)2 段段 1个个 (2)Fc段段 1个个 (1)Fab(1)Fab段段2 2个抗原结合片段个抗原结合片段 fragment with antigen binding (2)Fc段段 1个可结晶片段个可结晶
4、片段 fragment crystallized (1)Porter 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 (1)F(ab)2 段段 1个个 结合颗粒性抗原出现凝集反应结合颗粒性抗原出现凝集反应 (2)Fc段段 1个个 无生物学活性无生物学活性(2)Nisonoff 胃蛋白酶胃蛋白酶(1 1)、轻链()、轻链(light chainlight chain,L L链)链)214214个氨基酸残基,个氨基酸残基,24KD24KD。分为:分为:与与2 2个亚型。个亚型。(2 2)、重链()、重链(heavy chainheavy chain,H H链)链)450-550450-550个氨基酸残基,个氨基酸残基,55
5、-75KD55-75KD。分为分为5 5类,类,、链。链。IgMIgM,IgGIgG,IgAIgA,IgDIgD,IgEIgE。2、重链和轻链、重链和轻链 3、可变区和恒定区、可变区和恒定区(1 1)可变区()可变区(Variable regionVariable region,V V区)区)L L链链N N端端 1/21/2处处(VLVL)110110个个aaaa;H H链链N N端端1/5-1/41/5-1/4处处(VHVH)118118个个aaaa。互补决定区互补决定区(complementaritycomplementarity-determining-determining regi
6、on,CDRregion,CDR),),HVR1HVR1,HVR2HVR2,HVR3HVR3又分别称为又分别称为CDR1CDR1,CDR2CDR2,CDR3CDR3骨架区骨架区(framework region,FRframework region,FR)高变区高变区(hypervariablehypervariable region,HVR region,HVR)(2 2)恒定区()恒定区(constant regionconstant region,C C区)区)L L链链C C端端1/21/2处,处,105105个个aaaa;H H链链C C端端3/4-4/53/4-4/5处,处,331
7、-431331-431个个aaaa。4、功能区、功能区(1 1)L L链:链:2 2个,个,VLVL,CLCL各各1 1(2 2)H H链:链:IgGIgG,IgAIgA,IgDIgD:4 4个(个(V V区区1 1个,个,C C区区3 3个)个)IgMIgM,IgEIgE:5 5个(个(V V区区1 1个,个,C C区区4 4个)个)(3 3)功能区的作用:)功能区的作用:(a a)VLVL和和VHVH:结合抗原决定簇(:结合抗原决定簇(FVFV区)区)(b b)CLCL和和CHCH:具有同种异型的遗传标记:具有同种异型的遗传标记(c c)CH2CH2:结合补体:结合补体(d d)CH3CH
8、3:结合:结合FcFc受体受体单核细胞,巨噬细胞,粒细胞,单核细胞,巨噬细胞,粒细胞,B B细胞,细胞,NKNK细胞细胞C+V2Fab+FcF(ab)2+FcV=FR+HVR=FR+CDRC=CL+CH1+CH2+CH3Ab=CDR1CDR2CDR3第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体 McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法及克隆力的骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗
9、体,又是单一的抗体,又是单一的B淋巴细胞克隆产生的,故淋巴细胞克隆产生的,故称为单克隆抗体。称为单克隆抗体。一、单克隆抗体制备过程一、单克隆抗体制备过程注射抗原注射抗原 B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选,继续培养筛选,继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群 体外培养体外培养(注射到小鼠腹腔)(注射到小鼠腹腔)体内培养体内培养单克隆抗体单克隆抗体传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体混合混合1 234BALB/c12341 234多克隆抗体制备过程多克隆抗体制备过程1
10、234mmmm12341234单单抗抗细胞融合细胞融合取出脾細胞取出脾細胞+癌細胞癌細胞各抗各抗体体分分开开单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 1、抗原与动物免疫、抗原与动物免疫 抗原:颗粒性抗原和可溶性抗原抗原:颗粒性抗原和可溶性抗原免疫动物:免疫动物:BALB/cBALB/c小鼠或小鼠或LouLou大鼠大鼠免疫方法:体内免疫和体外免疫免疫方法:体内免疫和体外免疫2 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本方法:取适量脾细胞(基本方法:取适量脾细胞(1*108)与骨髓瘤)与骨髓瘤细胞(细胞(2*1073*107)进行混合,在)进行混合,在PEG作用作用下诱
11、导它们融合,时间控制在下诱导它们融合,时间控制在2min以内,然以内,然后用培养液将后用培养液将PEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释 用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高,用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高,自身不分泌抗体,所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的自身不分泌抗体,所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。能力强且长期稳定等特点。PEG的相对分子质量和浓度越大,其促融和率越的相对分子质量和浓度越大,其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为度为40%50%,相对分子质量,相对分子质量4000为佳。相对分子为佳。相对分
12、子质量在质量在4006000,浓度在,浓度在10%60%范围内的范围内的PEG都都能使细胞发生融合。为了提高融合率,在能使细胞发生融合。为了提高融合率,在PEG 溶液溶液中加入中加入DMSO,以提高细胞接触的紧密性,增加融,以提高细胞接触的紧密性,增加融合率。但必须严格限制接触时间。合率。但必须严格限制接触时间。(1 1)细胞融合液中的细胞类型:)细胞融合液中的细胞类型:4 4或或5 5种。种。(2 2)如何去除脾)如何去除脾-瘤以外的融和细胞?瘤以外的融和细胞?HAT培养基:培养基:H(Hypoxanthine):次黄嘌呤次黄嘌呤A(Aminopterin):):氨基喋呤;叶酸拮抗物,阻氨基
13、喋呤;叶酸拮抗物,阻断断DNA合成主要途径合成主要途径 T(Thymidine):胸腺嘧啶核苷;胸腺嘧啶核苷;“核苷酸前体核苷酸前体”,供细胞通过替代途径合成供细胞通过替代途径合成DNAHATHAT选择作用:选择作用:淋巴细胞:淋巴细胞:不能生长,不能生长,5 57 7天死亡;天死亡;DNADNA合成合成的主要途径被的主要途径被A A阻断阻断骨髓瘤细胞:骨髓瘤细胞:不能生长,不能生长,5 57 7天死亡;天死亡;HGPRTHGPRT缺乏,缺乏,DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻 杂交瘤细胞:杂交瘤细胞:长期生长繁殖;利用淋巴细长期生长繁殖;利用淋巴细胞的胞的HGPRT,将,将H合
14、成为嘌呤碱并最终与合成为嘌呤碱并最终与T一一起合成起合成DNA3 3、筛选阳性克隆与克隆化、筛选阳性克隆与克隆化 常用的克隆化方法:有限稀释法和软琼脂法。常用的克隆化方法:有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法:把杂交有限稀释法:把杂交瘤细胞悬液稀释后,加入到瘤细胞悬液稀释后,加入到9696孔板孔板,使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一,使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用次克隆化时也要应用HTHT培养液,以后的克隆化可用培养液,以后的克隆化可用不含不含HTHT的的RPMI 1640RPMI 1640培养液。培养液。软琼脂法:在培养液中加入软琼脂法:在培养液中加入0.5%0.5%的
15、琼脂糖凝胶,的琼脂糖凝胶,细胞分裂后形成小球样团块,由于培养基是半固体细胞分裂后形成小球样团块,由于培养基是半固体状态,可用吸管吸出,移入状态,可用吸管吸出,移入9696孔板培养。孔板培养。4 4、单抗检测、单抗检测RIARIA(放射免疫测定)(放射免疫测定)ELISAELISA(酶联免疫吸附试验)(酶联免疫吸附试验)FACSFACS(流式细胞仪)(流式细胞仪)IFAIFA(间接免疫荧光法)(间接免疫荧光法)配制方案:配制方案:杂交瘤细胞(杂交瘤细胞(1 15 5)x10 x106 6/ml)+/ml)+细胞冻存液细胞冻存液(30%(30%40%40%牛血清,牛血清,50%50%60%RPMI
16、-164060%RPMI-1640培养液,培养液,10%DMSO)10%DMSO)“慢冻慢冻”:分步冷冻,分步冷冻,30-7030-70液氮液氮“快融快融”:取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中,使其迅速融化、水浴中,使其迅速融化、复苏复苏5 5、杂交瘤细胞的冻存与复苏、杂交瘤细胞的冻存与复苏细胞冷冻的意义:细胞冷冻的意义:防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防止细胞密度过高而死亡 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养(除及时冻存的细胞外)。因多次
17、传立即扩大培养(除及时冻存的细胞外)。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失,还应尽早使用获得的抗体阳性杂渐减弱甚至消失,还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。交瘤细胞株制备单克隆抗体。6 6、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大量制备可获得可获得10g/ml的抗体。多采用的抗体。多采用RPMI 1640培养液,培养液,添加添加10%20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分,总蛋白量可达血清成分,总蛋白量可达100g/ml以上,给纯化带来以上,给纯化带来困难。加入小
18、牛血清又是发生支原体污染的原因,而困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因,而且批间质量差异太大,直接且批间质量差异太大,直接影响杂交瘤细胞的生长。影响杂交瘤细胞的生长。改良的方法有:无血清改良的方法有:无血清培养法、悬浮培养法、微载体培养法、悬浮培养法、微载体悬浮悬浮培养法。培养法。无血清培养法无血清培养法:利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙:利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染,但醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染,但产量不高。产量不高。悬浮培养法悬浮培养法:连续悬浮培养的细胞密度可:连续悬浮培养的细胞密度可2*107/ml,收收集的单克隆抗体
19、可达集的单克隆抗体可达400 g/ml。如在培养液中加入微。如在培养液中加入微载体,细胞密度可达载体,细胞密度可达108。(1)体外培养法:)体外培养法:基本程序:接种前基本程序:接种前12周,小鼠腹腔注射周,小鼠腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)或用液体石蜡,然后注射(降植烷)或用液体石蜡,然后注射1*106杂杂交瘤细胞,交瘤细胞,712d便有腹水生成,待生成腹水后再提便有腹水生成,待生成腹水后再提取,离心去细胞沉淀,取上清液冻存。取,离心去细胞沉淀,取上清液冻存。优点:操作简便,比较经济,所得单克隆抗体量多优点:操作简便,比较经济,所得单克隆抗体量多且效价高,还可有效地保存杂交
20、瘤细胞株和分离已污且效价高,还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点:小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白,给缺点:小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白,给纯化带来难度。纯化带来难度。(2)动物体内诱生法)动物体内诱生法可获得可获得10m/ml的抗体。常用方法的抗体。常用方法。腹腔注射法腹腔注射法7 7、单克隆抗体的纯化、单克隆抗体的纯化根据根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法:的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法:体外诊断试剂体外诊断试剂IgG类类-沉淀处理沉淀处理+亲和层析亲和层析 IgM类类-沉淀处理沉淀处理+凝胶过滤凝胶过滤体内诊断试剂或
21、治疗用药体内诊断试剂或治疗用药-亲和层析亲和层析+阴离子交换阴离子交换层析,注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。层析,注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。盐析沉淀盐析沉淀亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析 McAbMcAb的纯化的纯化 8 8、单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的性质鉴定IgIg类型、亚类测定:类型、亚类测定:双扩法或双扩法或ELISAELISA法法特异性测定:特异性测定:抗原类似物的交叉反应抗原类似物的交叉反应效价测定:效价测定:用腹水或培养液的稀释度表示用腹水或培养液的稀释度表示表位测定:表位测定:几株单抗是否为不同表位特异的几株单抗是否为不同表位特异的,用竞用竞
22、 争抑制争抑制法,相加指数法及微机集群分析法,相加指数法及微机集群分析亲和性测定:亲和性测定:测定亲和常数测定亲和常数K K杂交瘤细胞染色体:杂交瘤细胞染色体:秋水仙素裂解法,小鼠秋水仙素裂解法,小鼠B B细胞染色体细胞染色体4040条,条,SP2/0SP2/0细胞细胞6868条,杂交瘤细胞一般条,杂交瘤细胞一般100100多条多条McAbMcAb靶抗原分子量:靶抗原分子量:常用常用western blotwestern blot单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性高度特异性高度特异性高度的均一性和可重复性高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性对环
23、境敏感性A、McAb均是鼠源性抗体,应用于人体内可产均是鼠源性抗体,应用于人体内可产生人抗鼠抗体(生人抗鼠抗体(HAMA),加速了排斥反应,),加速了排斥反应,在人体内的半衰期只有在人体内的半衰期只有56h,维持有效药物作,维持有效药物作用靶组织时间;用靶组织时间;B、完整的抗体分子的相对分子质量过大,难、完整的抗体分子的相对分子质量过大,难以穿透实体肿瘤组织,达不到有效的治疗浓度。以穿透实体肿瘤组织,达不到有效的治疗浓度。McAb 在免疫导向疗法中存在的问题(障碍):在免疫导向疗法中存在的问题(障碍):A、降低、降低McAb的免疫源性;的免疫源性;B、降低、降低McAb的相对分子质量的相对分
24、子质量需要解决的问题:需要解决的问题:解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体,之后制备鼠嵌合抗体,之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型,基本上消除了抗体的识别单位等多种类型,基本上消除了抗体的鼠源性(免疫源性),相对分子质量只有完鼠源性(免疫源性),相对分子质量只有完整抗体分子的整抗体分子的1/801/3。优点优点 :在体外在体外“永久永久”地存活并传代地存活并传代用相对不纯的抗原,获得大量高度特异的、均一的抗用相对不纯的抗原,获得大量高度特异的、均一的抗体。适用
25、于以标记抗体为特点的免疫学分析方法体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗单克隆抗体的优点与局限性单克隆抗体的优点与局限性局限性局限性 :固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高制备技术复杂、费时费工、价格较高第三节第三节 基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体(Genetic engineering antibody)指用基因工程方法,对抗体的基因进行重组、指用基因工程方法,对抗
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