动物遗传学实验课件.ppt

1、实验一 外周血淋巴细胞培养及染色体标本制作动物遗传学实验l 掌握兔外周血细胞常规核型的标本制备方法掌握兔外周血细胞常规核型的标本制备方法l 熟悉外周血淋巴细胞培养方法熟悉外周血淋巴细胞培养方法一、目的与要求一、目的与要求 二、实验原理二、实验原理PHA秋水仙素秋水仙素低渗、固定、滴片、染色低渗、固定、滴片、染色三三实实验验流流程程7ml Carnoy液液 15 min7ml Carnoy液液 15 min固定固定重固定重固定制备细胞悬液制备细胞悬液滴片、晾干、染色滴片、晾干、染色加加0.2ml 新选固定液新选固定液 视细胞量视细胞量离心并弃上清离心并弃上清综合培养基配置综合培养基配置（严格无菌

2、）（严格无菌）采血、接种采血、接种（严格无菌）（严格无菌）预热的预热的0.075M KCl低渗处理低渗处理预固定预固定37水浴水浴 16min1ml Carnoy1000 r/min 10min收集细胞于收集细胞于10ml离心管离心管1500 r/min 10min离心离心离心并弃上清离心并弃上清1000 r/min 10min离心并弃上清离心并弃上清1000 r/min 10min培养培养秋水仙素处理秋水仙素处理镜检镜检1、综合培养基配置、综合培养基配置RMPI1640 4ml 供给细胞营养，促进细胞增殖的基础物质供给细胞营养，促进细胞增殖的基础物质小牛血清小牛血清 1ml 提供基本营养物质

3、和各种生长因子提供基本营养物质和各种生长因子PHA 3mg/5ml 细胞刺激剂细胞刺激剂双抗双抗 各各25IU/ml 防止细胞污染防止细胞污染肝素肝素 1.5 IU/ml 抗凝抗凝注意事项：注意事项：在超净台内工作，严格无菌，防止细胞污染在超净台内工作，严格无菌，防止细胞污染四、具体步骤四、具体步骤2、采血、采血采血动物：兔采血动物：兔采血部位：耳缘静脉采血部位：耳缘静脉抗凝剂：肝素抗凝剂：肝素注意事项：注意事项：l采血过程中严格执行无菌操作；采血过程中严格执行无菌操作；l采血时，注意不要加入太多的肝素，因为肝素过多时可能引致采血时，注意不要加入太多的肝素，因为肝素过多时可能引致溶血和抑制淋巴

4、细胞的转化和分裂，但肝素量也不应过少，以免溶血和抑制淋巴细胞的转化和分裂，但肝素量也不应过少，以免采血时发生凝血现象或培养物出现纤维蛋白形成的膜状结构。采血时发生凝血现象或培养物出现纤维蛋白形成的膜状结构。3、接种、接种0.30.5ml血血/5ml培养基培养基注意事项：注意事项：接种过程中严格执行无菌操作。接种过程中严格执行无菌操作。4、细胞培养、细胞培养39的恒温箱中培养的恒温箱中培养68-70h 注意事项：注意事项：培养时，必须将瓶口塞紧，以免培养液的培养时，必须将瓶口塞紧，以免培养液的pH发生较大的变化。发生较大的变化。5、秋水仙素处理、秋水仙素处理 在终止培养前在终止培养前2-3小时，

5、开始滴加秋水仙素，使得最小时，开始滴加秋水仙素，使得最终浓度为终浓度为0.24g/ml，摇匀，放回恒温培养箱内继续培养。，摇匀，放回恒温培养箱内继续培养。秋水仙素处理不当秋水仙素处理不当:如秋水仙素质量有间题或秋水仙素的浓如秋水仙素质量有间题或秋水仙素的浓度、处理时间不够或处理不合适，结果分裂相少度、处理时间不够或处理不合适，结果分裂相少;如果秋水仙素如果秋水仙素浓度过高或处理时间过长，则使染色体过于缩短，难以进行分浓度过高或处理时间过长，则使染色体过于缩短，难以进行分析。析。注意事项：注意事项：6、收集细胞、收集细胞由恒温培养箱取出培养瓶，用吸管将瓶壁上的细胞轻轻冲由恒温培养箱取出培养瓶，用

6、吸管将瓶壁上的细胞轻轻冲散均匀，并用吸管移至离心管内。散均匀，并用吸管移至离心管内。以以 1500转转/分离心分离心10分钟。分钟。离心速度不合适离心速度不合适:如果从培养瓶收集细胞迸行离心时的速度如果从培养瓶收集细胞迸行离心时的速度太低，则细胞多被丢失。太低，则细胞多被丢失。注意事项：注意事项：7、低渗、低渗 培养后的细胞经低渗处理后，使红细胞破碎，白细培养后的细胞经低渗处理后，使红细胞破碎，白细胞膨胀，染色体分散而有利于观察。胞膨胀，染色体分散而有利于观察。7mL预温预温39的的0.075M KCl溶液溶液 处理处理16min低渗处理不当：低渗处理不当：低渗处理时间过长时，细胞膜往往过早破

7、裂，低渗处理时间过长时，细胞膜往往过早破裂，引致分裂细胞丢失，或染色体丢失；如果处理时间不足时，细引致分裂细胞丢失，或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。离心速度不合适离心速度不合适:如果低渗后离心速度过高，则往往使分裂细胞如果低渗后离心速度过高，则往往使分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相多被丢失，以致制出的标本中分过早破裂，分散良好的分裂相多被丢失，以致制出的标本中分裂相少或大部分为剩余的分散不好为分裂相。裂相少或大部分为剩余的分散不好为分裂相。注意事项：注意事项：8、固定、固定预固定预

8、固定 1mL 1min第一次固定第一次固定 7mL 1min第二次固定第二次固定 7mL 1min 固定是组织、细胞或其成分选择性地固定于某一特固定是组织、细胞或其成分选择性地固定于某一特定阶段的过程。其目的是杀死细胞但又要避免所研究的定阶段的过程。其目的是杀死细胞但又要避免所研究的成分受到破坏。成分受到破坏。注意事项：注意事项：现配现用现配现用混匀使用混匀使用标本固定不充分标本固定不充分:如固定液不新鲜，或甲醇、冰醋酸的质量不佳，此如固定液不新鲜，或甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时，染色体形象模糊，染色体周围有胞浆背景。时，染色体形象模糊，染色体周围有胞浆背景。9、制片、制片 留固定液留固定液0

9、.2ml0.4ml，轻轻冲打制成细胞悬液。冰，轻轻冲打制成细胞悬液。冰冻载波片，滴管口距离载玻片冻载波片，滴管口距离载玻片1015cm，每片，每片23滴。滴。载玻片：载玻片：去油、冷冻去油、冷冻玻片去油不彻底：玻片去油不彻底：玻片有油迹时，将使滴上的细胞悬液不能均匀玻片有油迹时，将使滴上的细胞悬液不能均匀分散，且将使细胞随液滴流动而丢失。分散，且将使细胞随液滴流动而丢失。玻片冷冻不够：合适的冰湿载玻片，从冰水中拿出时，玻片一表玻片冷冻不够：合适的冰湿载玻片，从冰水中拿出时，玻片一表面浮霜，如冷冻不够则无此现象，此时细胞难以贴附而可能造成面浮霜，如冷冻不够则无此现象，此时细胞难以贴附而可能造成丢

10、失。丢失。注意事项：注意事项：10、染色、染色 用磷酸缓冲液稀释用磷酸缓冲液稀释Giemsa（20 1）原液染色）原液染色10-15分钟，分钟，然后用自来水冲洗，晾干。然后用自来水冲洗，晾干。Giemsa染液须现配现用染液须现配现用注意事项：注意事项：11、镜检、镜检 先用低倍镜寻找良好的分裂相，再用高倍油镜观察。先用低倍镜寻找良好的分裂相，再用高倍油镜观察。五、实验结果五、实验结果实验二 人类染色体核型分析一、目的与要求一、目的与要求 l 理解染色体组型分析的各种数据指标理解染色体组型分析的各种数据指标l 掌握染色体组型分析的基本方法掌握染色体组型分析的基本方法二、实验原理二、实验原理l 染

11、色体组型染色体组型又称核型，是指将动物、植物、真菌又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。征排列起来的图像。l 核型图核型图是指将一个染色体组的全部染色体逐个按是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。来的图像。三、组型分析方法三、组型分析方法1、染色体自动分析系统、染色体自动分析系统图像处理图像处理病案信息编辑病案信息编辑系统启动

12、系统启动染色体核型分析染色体核型分析报告输出报告输出2、Photoshop软件处理软件处理 3、手工操作、手工操作（本实验方法）（本实验方法）分组排队原则分组排队原则l 着丝粒类型相同，相对长度相近的分一组着丝粒类型相同，相对长度相近的分一组l 同一组的按染色体长短顺序配对排列同一组的按染色体长短顺序配对排列l 各指数相同的染色体配为一对各指数相同的染色体配为一对l 可根据随体的有无进行配对可根据随体的有无进行配对l 将染色体按长将染色体按长短排队，短臂向上短排队，短臂向上人类染色体的编组和各组染色体的特征人类染色体的编组和各组染色体的特征 （Denver体制）体制）组组编号编号大大小小着丝粒

13、 位置副缢痕随体鉴 别 难易备 注A13最大1,3中央 2亚中1号q常见无可鉴别 B45较大亚中 无不易短臂较短C612+X中等亚中9号q常见无 难6、7、8、11号短臂较长，9、10、12短臂较短。D1315中等近端 有难 E1618较小16中央17,18亚中16号q常见无可鉴别18号短臂比17较短F1920小中央 无不易 G2122 +Y最小近端 21,22有Y无不 易，可鉴别Y21号22号，长臂分开，Y长臂平行1、计数：、计数：取正常人体细胞染色体照片，先划分若干取正常人体细胞染色体照片，先划分若干个区，分别计数，然后相加，计数结果，染色体的个区，分别计数，然后相加，计数结果，染色体的数

14、目为数目为46条。条。2、剪贴：、剪贴：将照片上的染色体逐个剪下放好。注意小将照片上的染色体逐个剪下放好。注意小心操作切勿丢失染色体。心操作切勿丢失染色体。四、实验步骤四、实验步骤3、配对分组：、配对分组：将剪下的染色体按照将剪下的染色体按照Denver体制体制 区别，区别，正常人染色体可配成正常人染色体可配成23对，分成对，分成A、B、C、D、E、F、G 7组，分别配对。然后贴在试验报告单上。粘贴以前组，分别配对。然后贴在试验报告单上。粘贴以前先在纸上画好各组染色体排列的横线，并注明组别和先在纸上画好各组染色体排列的横线，并注明组别和染色体序号。然后将染色体的短臂朝上，长臂朝下，染色体序号。

15、然后将染色体的短臂朝上，长臂朝下，贴在相应组的相应位置上。性染色体单独列为一组贴在相应组的相应位置上。性染色体单独列为一组4、调整：、调整：在分组配对的基础上仔细推敲你所排列的顺序，在分组配对的基础上仔细推敲你所排列的顺序，是否符合上述各组的特征。如有不当，应作调整，直是否符合上述各组的特征。如有不当，应作调整，直至最佳。至最佳。5、标明染色体的核型、标明染色体的核型(核型描述核型描述)l 列出染色体总数，然后是性染色体组成，列出染色体总数，然后是性染色体组成，l 列出异常的染色体数目或形态。下列统一的命名符号：列出异常的染色体数目或形态。下列统一的命名符号：A-G 染色体组的名称染色体组的名

16、称 1-22 染色体编号染色体编号 X,Y 性染色体性染色体 del 缺失缺失 der 结构重排的染色体结构重排的染色体 dup 重复重复 inv 倒位倒位 t 易位易位+/-在染色体符号前表示染色体增加或减少，在染色体符在染色体符号前表示染色体增加或减少，在染色体符号后表示染色体多出或缺少一部分号后表示染色体多出或缺少一部分五、实验结果五、实验结果13141516171867891011121234519202122X YABCDEFG人类染色体核型（46，XY）实验三 动物细胞DNA的提取 掌握动物细胞掌握动物细胞DNA的提取过程，为基因和的提取过程，为基因和基因组的研究提供基本材料。基因

17、组的研究提供基本材料。真核生物的真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备因此，制备DNA的原则是既要将的原则是既要将DNA与蛋白质等分离，与蛋白质等分离，又要保持又要保持DNA分子的完整。提取分子的完整。提取DNA的一般过程是将的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白）和蛋白酶酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽异戊醇抽提分离蛋白质，得到的提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使溶液经乙醇沉淀使DNA从从溶液中析出。溶液中析出。1.十

18、二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDS）：）：可破坏细胞膜、核膜，使组可破坏细胞膜、核膜，使组织蛋白与织蛋白与DNA分离。分离。2.EDTA(乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸)：使：使DNA酶失活。酶失活。3.蛋白酶蛋白酶K：降解蛋白质、使：降解蛋白质、使DNA分子完整地分离出来。分子完整地分离出来。4.酚和氯仿酚和氯仿/异戊醇：分离蛋白质，抽提异戊醇：分离蛋白质，抽提DNA。5.Tris饱和酚：分离蛋白质、要避光保存。饱和酚：分离蛋白质、要避光保存。冷冻离心机冷冻离心机 电热恒温水浴锅电热恒温水浴锅 紫外分光光度计紫外分光光度计 从兔子的耳静脉采取从兔子的耳静脉采取500l血样，放入含有抗凝剂的血样，放

19、入含有抗凝剂的1.5毫升的离心管中，加入毫升的离心管中，加入 等体积等体积PBS缓冲液，摇匀，缓冲液，摇匀，5000 rpm 4离心离心5 min，弃上清液，共重复，弃上清液，共重复3次次 加加500l细胞裂解液，充分混匀后加入细胞裂解液，充分混匀后加入5l蛋白酶蛋白酶K （终浓度为（终浓度为100g/mL），），55水浴，过夜消化水浴，过夜消化 加入等体积的加入等体积的Tris-饱和酚（约饱和酚（约500l），摇晃），摇晃20分钟分钟 后，使蛋白质充分析出后，后，使蛋白质充分析出后，13000rpm 离心离心5 min 转移上清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（转移上清液，加入等体积的酚：氯

20、仿：异戊醇（25:24:1）摇摇5in，13000rpm 离心离心5 min 转移上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（转移上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）摇摇5in，13000rpm 离心离心5 min 取上清，加入取上清，加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，可看到絮状沉淀，放置倍体积的预冷的无水乙醇，可看到絮状沉淀，放置5min，沉淀，沉淀DNA 弃上清，加弃上清，加75%的乙醇洗一次，轻轻摇晃后，的乙醇洗一次，轻轻摇晃后，13000rpm 离心离心5 min 加入加入30l的的ddH2O 55水浴溶解水浴溶解5min 1.1 得到整齐一致的得到整齐一致的DNA条带，表明本次试验从动

21、物细胞中提取到基因条带，表明本次试验从动物细胞中提取到基因组组DNA符后续试验的质量要求。符后续试验的质量要求。琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测实验四 琼脂糖凝胶电泳掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。琼脂糖凝胶电泳可用于分离，鉴定和纯化琼脂糖凝胶电泳可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。琼脂凝片段。琼脂凝胶作为支持物胶作为支持物,利用利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达达到分离混合物的目的。不同大小的到分离混合物的目的。不同大小的DNA 分子在相同的电泳条件下分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压

22、、缓冲液等如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭可与荧光染料溴化乙锭(EB)结结合，在紫外灯下可看到荧光条带，用于分析实验结果。不同浓度合，在紫外灯下可看到荧光条带，用于分析实验结果。不同浓度的琼脂糖可以分离不同长度范围的的琼脂糖可以分离不同长度范围的DNA分子。分子。如：如：0.3%的琼脂糖凝胶可以分离的琼脂糖凝胶可以分离5-60Kb长度的长度的DNA，而而2%的琼脂糖可以分离的琼脂糖可以分离0.1-3kb的的DNA分子。由于分子。由于DNA带负电荷，带负电荷，迁移率与分

23、子量对数成反比。迁移率与分子量对数成反比。琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（%）分离范围（分离范围（kb）0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 琼脂糖凝胶电泳系统琼脂糖凝胶电泳系统 紫外成像凝胶分析系统紫外成像凝胶分析系统1.给胶板中倒入凝胶时，避免气泡，否则会影响电泳效果。给胶板中倒入凝胶时，避免气泡，否则会影响电泳效果。2.加样量的多少依梳孔大小而定，过多会导致拖尾和弥散。加样量的多少依梳孔大小而定，过多会导致拖尾和弥散。3.电泳使要加入电泳使要加入DNA标准参照物。标准参照物。4.制胶缓冲液应和电泳

24、系统中的缓冲液浓度保持一致。制胶缓冲液应和电泳系统中的缓冲液浓度保持一致。5.制胶时一定要溶解彻底，凝胶溶液要成透亮，一定要加入制胶时一定要溶解彻底，凝胶溶液要成透亮，一定要加入 EB。6.电泳时要盖好电泳槽，防止液体蒸发。电泳时要盖好电泳槽，防止液体蒸发。1.琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备 制作制作1%的凝胶：称取的凝胶：称取0.3克的琼脂糖凝胶置于克的琼脂糖凝胶置于30ml 0.5TAE缓冲液中，缓冲液中，加热后使琼脂糖完全溶解，加热后使琼脂糖完全溶解，待冷却后，加入待冷却后，加入2lEB。2.凝胶板的制备凝胶板的制备 将制备好的液将制备好的液体琼脂糖凝 胶 倒 入体琼脂糖凝 胶 倒 入

25、制备好的胶槽中，制备好的胶槽中，凝凝固固30min，拔出梳子，拔出梳子，给电泳槽中加入缓冲给电泳槽中加入缓冲液。液。3.样品的制备：将待测样品和样品的制备：将待测样品和加样缓冲液以加样缓冲液以6:1的比例混合均的比例混合均匀，加入点样空。匀，加入点样空。4.加样：加样端为负极加样：加样端为负极 5.电泳：根据电泳槽的电泳：根据电泳槽的 长度决定适当的电压。长度决定适当的电压。当溴酚蓝染料移动到当溴酚蓝染料移动到 距凝胶边缘距凝胶边缘12cm处，处，停止电泳停止电泳6.观察：紫外灯下观察，照相观察：紫外灯下观察，照相 通过琼脂糖凝胶电泳，使不同大小的通过琼脂糖凝胶电泳，使不同大小的DNA分子有效

26、分离分子有效分离 实验五 兔SRY基因PCR扩增 掌握兔掌握兔SRY基因的扩增方法，实现家兔性别的快速鉴定。基因的扩增方法，实现家兔性别的快速鉴定。掌握掌握PCR扩增的基本原理和操作方法。扩增的基本原理和操作方法。SRY基因（基因（sex-related Y）：是性别决定基因，位于）：是性别决定基因，位于Y染染色体上，在雄性兔子基因组中可以色体上，在雄性兔子基因组中可以检测到检测到SRY基因的表达，因此，基因的表达，因此，可以利用可以利用SRY基因对兔进行早期基因对兔进行早期性别鉴定。性别鉴定。PCR（Polymerase Chain Reaction）技术原理：）技术原理：PCR技术是一种体

27、外核酸扩增技术是一种体外核酸扩增系统，根据系统，根据SRY的序列，合成的序列，合成特异引物，经特异引物，经PCR扩增仪的变扩增仪的变性、退火和延伸三个步骤的多性、退火和延伸三个步骤的多次循环，形成与模板链互补的次循环，形成与模板链互补的新新DNA链。链。DNA产物以指数的产物以指数的形式增加形式增加 PCR仪仪 琼脂糖凝胶电泳系统琼脂糖凝胶电泳系统 紫外成像凝胶分析系统紫外成像凝胶分析系统 1.设计引物：设计引物：根据欧洲家兔特异性根据欧洲家兔特异性SRY基因序列基因序列(登录号登录号:AY785433)设设计引物计引物:SRY-F 5-taaagtgagcggccaggaac-3,SRY-R

28、:5-gcacagcgtggaagtaggtt-3 ddH2O 13.2l10Buffer2.0ldNTP1.5l上下游引物上下游引物1.0l模板模板1.0l（50100ng）总体积总体积20.0l95预变性预变性 5min94变性变性 45s58退火退火 45s72 延伸延伸 45s72延伸延伸 10 min35cycle 产物长度为产物长度为350bp，因此扩增产物经，因此扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳后，雄性有扩增产物，而雌性无扩增产物，表明可以对后，雄性有扩增产物，而雌性无扩增产物，表明可以对SRY基基因进行因进行PCR扩增可对对家兔胚胎进行性别鉴定。扩增可对对家兔胚胎进行性别鉴定。