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1、粗糙链孢霉的分离和交粗糙链孢霉的分离和交换换实验目的实验目的 1.用粗糙链孢霉的赖氨酸缺陷型和野生型进行杂交，并观察杂交所得后代的子囊孢子的分离和交换现象。2.掌握顺序排列四分体的遗传学分析方法，进行有关基因与着丝粒距离的计算和作图，加深理解基因分离和连锁交换规律。实验原理实验原理 粗糙链孢霉(Neurospora crassa，2n14)，又称红色面包霉，在分类学上属于真菌中的子囊菌纲、球壳目、脉孢菌属，目前已知有45种。利用粗糙链孢霉进行遗传学分析有如下优点：个体小，生长快，容易培养；既可进行有性繁殖，又可进行无性繁殖，一次杂交可产生大量后代；染色体与高等生物一样，研究结果可广泛应用于遗传

2、学上；无性世代是单倍体，没有显隐性，基因型可以直接在表型上反映出来；一次只需分析一个减数分裂的产物，就可以观测倒遗传结果，简单易行，而二倍体合子是两个不同减数分裂产生的配子相互结合的结果，需要通过测交实验才能分析减数分裂的结果，手续麻烦。因此粗糙链孢霉是进行基因分离和连锁交换遗传分析的好材料。粗糙链孢霉的营养体是由单倍体（n7）的多细胞菌丝体和分生孢子所组成，生活方式由有性和无性两种。菌丝经有丝分裂直接发育成菌丝体，称无性生殖。而两种不同接合型细胞结合产生有性孢子的过程称有性生殖。无性繁殖过程，由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分生孢子有两种，小型分生孢子中只含有一个核，大型分生孢子有几个核。分生孢

3、子萌发成菌丝，可以再生成分生孢子，周而复始（见下图）。在有性生殖过程中，粗糙链孢霉的菌株有两种不同接合型(mating type)，它们受一对等位基因控制。不同接合型菌株的细胞接合产生子囊果及子囊孢子。粗糙链孢霉的生活史 13为无性繁殖；49为有性繁殖。图中间示基因交换发生位置及子囊孢子的排列顺序，（1）（2）为非交换型；（3）（4）（5）（6）为交换型 粗糙链孢霉的子囊孢子是单倍体细胞，由它发芽长成的菌丝体也是单倍体。所以由一对等位基因决定的性状在F1就能分离。并且，它的一次减数分裂产物包含在一个子囊中，可以直接观察到基因分离，并证明基因在染色体上。同时，再一次有丝分裂后，8个子囊孢子有顺序

4、地排列在子囊中，就可以测定着丝粒距离和发现基因转变。交换型子囊的出现，是由于核基因与着丝点之间发生了一次染色体片段的交换的结果，即由第一次分裂分离形成的子囊为非交换型子囊，第二次分裂分离形成的子囊为交换型子囊，因而第二次分裂分离的子囊数量愈多，表明有关基因和着丝粒的距离愈远。根据第二次分裂分离子囊的频数，就可以计算出某一基因和着丝粒间的距离，这距离称为着丝粒距离。由于交换只发生在二价体的4条染色单体中的2条之间，当每发生一次交换时，便产生一个第二次分裂分离子囊，所以交换型子囊中仅有一半子囊孢子属于重组类型，因此必须将第二次分裂分离子囊的百分率除以2，就是某一基因与着丝粒间的重组值，计算公式如下

5、：着丝粒和基因间的重组值 重组值除去，即为图距：某基因的着丝粒距离 图距单位子囊总数第二次分裂分离自囊数1002110021子囊总数第二次分裂分离子囊数实验器具和药品实验器具和药品 1.仪器用具：显微镜、镊子、解剖针、接种针、载玻片、试管、酒精灯、滤纸。2.药品试剂：CaCl2、NaCl、NH4NO3、MgSO4.7H2O、KH2PO4、蔗糖、酒石酸铵、生物素、赖氨酸、5次氯酸钠、5石炭酸、3来苏尔、蒸馏水、苯酚、琼脂、马铃薯、玉米粒。实验材料实验材料 粗糙链孢霉野生型菌株(Lys)，赖氨酸缺陷型菌株(Lys)。实验步骤实验步骤 1.菌种活化 进行杂交实验前，要先把冷冻保存的菌种活化。把野生型

6、和缺陷型菌种分别斜面接种到各自的试管培养基上，置于28恒温培养箱中培养57天，直至菌丝上部有分生孢子产生，长好的菌株在菌丝上部可见红粉状孢子。保存和活化可用马铃薯培养基。2.接种杂交 在无菌条件下，先将接种环挑取lys-菌株的菌丝或分生孢子，团块直径约36mm，接种于杂交培养基上，再挑取Lys+菌株的菌丝或分生孢子，团块直径约12mm，接种在同一杂交培养基上，让其杂交。接种时，试管口应靠近火焰，以防污染，并贴上标签，然后放在25恒温培养箱中培养，约经14天左右，可看到棕黑色的成熟子囊，此时即可在显微镜下观察分析。观察时要注意掌握好孢子的成熟程度，如过早，子囊中的孢子尚未成熟而呈白色，若偏迟，则

7、孢子全为黑色，对交换型和非交换型孢子难于区别。要掌握适宜的观察时期，最好是在子囊壳开始变黑时，每天取几个子囊果压片观察，当看到适合时即置于45冰箱中，可保存34周，延长观察时间。3.压片观察 将附有子囊果的滤纸条放入3来苏尔溶液中处理10min，杀死孢子，以防孢子飞扬污染实验室。取一载波片，滴一滴3来苏尔溶液，然后用接种针跳出子囊果放在载波片上，用镊子柄平压，或盖上另一载波片，用手指压片（这里用载波片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，盖玻片易破裂），压片时要适当用力压破子囊果，使子囊呈放射状逸出，但要注意不能让分生孢子散出，一个子囊果中会散出3040个子囊。压片时最好一次一个子囊果，多了

8、压不好。片子压好后，置于100显微镜下观察，观察时要顺时针方向观察，自中心向外确定子囊类型，计数并做好记录。此过程不需无菌操作，但也要注意对观察过的载玻片，用过的镊子和解剖针等用具都需放入来苏尔溶液中浸泡后取出洗净，以免污染实验室。粗糙链雹霉lys+与lys-杂交子囊孢子的排列方式图中（1）（2）为非交换型；（3）（5）（6）缺少（4）为交换型子囊作业作业 1观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，按不同的子囊类型计数填入表中，计算Lys基因与着丝粒间的距离。子囊类型 孢子排列方式 观 察 数 合 计 非交换类型（第一次分离裂）1 2 交换类型（第二次分离裂）3 4 5 6 2.分析粗糙链雹霉的子囊孢子分离和交换现象与高等动物、高等植物的性状分离和交换有什么不同，本实验结果说明了什么？