食品中大肠菌群的测定实验课件.pptx

1、大肠菌群的概念大肠菌群的概念大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在系指一群在37能发能发酵酵乳糖乳糖、产酸产酸、产气产气、需氧需氧和和兼性厌氧兼性厌氧的的革兰氏革兰氏阴性无芽胞杆菌阴性无芽胞杆菌。包括包括埃希氏菌属埃希氏菌属、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和克、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属雷伯氏菌属 测定意义测定意义 大肠菌群作为粪便污染指示菌。即在食品中检出即在食品中检出大肠菌群，不仅反映食品被粪便污染总的情况，大肠菌群，不仅反映食品被粪便污染总的情况，一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况，具有广泛的卫生学

2、意义。存等过程中的卫生状况，具有广泛的卫生学意义。凡是凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定即可确定其卫生学上是其卫生学上是不合格不合格的，该食品使用是不安全的。的，该食品使用是不安全的。大肠菌群数量的表示方法大肠菌群数量的表示方法-MPNMPN MPN:Most Probable Number(大肠菌群最可能数大肠菌群最可能数)是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。计算出的一种最近似数值。三管系列：三管系列：对样品进行连续对样品进行连续10倍梯度系列稀释，倍梯度系列稀释，选择选择3个连续的合适的稀释度，每个稀释度接种个

3、连续的合适的稀释度，每个稀释度接种3管到乳糖胆盐发酵管内培养，从规定的反应呈阳管到乳糖胆盐发酵管内培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，查取大肠菌群最可能数性管数的出现率，查取大肠菌群最可能数(MPN)检索表，报告每检索表，报告每100mL(g)检样大肠菌群的最近似检样大肠菌群的最近似数。数。大肠菌群大肠菌群MPN的检验方法的检验方法-多管发酵法多管发酵法 大肠菌群的检验程序稀释稀释大肠菌群阴性大肠菌群阴性革兰氏阳性革兰氏阳性伊红美蓝琼脂平板伊红美蓝琼脂平板报告报告乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管革兰氏阴性无芽孢革兰氏阴性无芽孢检样检样产气产气乳糖发酵管乳糖发酵管不产气不产气不产气不产气大肠菌群阴

4、性大肠菌群阴性大肠菌群阳性大肠菌群阳性报告报告报告报告报告报告大肠菌群阴性大肠菌群阴性革兰氏染色革兰氏染色产气产气过程过程检样稀释检样稀释乳糖初发酵试验（假定试验）乳糖初发酵试验（假定试验）分离培养分离培养乳糖复发酵试验（证实试验乳糖复发酵试验（证实试验）报告报告 检样稀释检样稀释 1.检样检样25mL(25g)放于含有放于含有225mL无菌生无菌生理盐水的三角瓶内，经充分振摇作成理盐水的三角瓶内，经充分振摇作成1:10的均匀稀释液。固体检样用无菌均质器。的均匀稀释液。固体检样用无菌均质器。以以8000-10000r/min的速度处理的速度处理1min，做成，做成 1:10的均匀稀释液；的均匀

5、稀释液；检样稀释检样稀释2.用用1mL无菌吸管吸取无菌吸管吸取1:10稀释液稀释液1mL，注入含有注入含有9mL无菌生理盐水的试管内，无菌生理盐水的试管内，振荡混匀，作振荡混匀，作1:100的稀释液；的稀释液；3.另取另取1mL无菌吸管，按上述操作依次作无菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液，每稀释一次换用倍递增稀释液，每稀释一次换用 1支支1mL无菌吸管；无菌吸管；检样稀释检样稀释4.根据食品卫生标准要求或对检样污染根据食品卫生标准要求或对检样污染情况估计，选情况估计，选3个稀释度，每稀释度接个稀释度，每稀释度接种种3管。管。每每100mL消毒乳中大肠菌群消毒乳中大肠菌群MPN不超不超过

6、过40个个 乳糖初发酵试验（假定试验）乳糖初发酵试验（假定试验）目的：检查样品中有无发酵乳糖产酸产气的细菌。目的：检查样品中有无发酵乳糖产酸产气的细菌。将待检样品接种于将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管内内;乳糖乳糖：选择作用，大肠菌群能发酵乳糖选择作用，大肠菌群能发酵乳糖产酸产气产酸产气;胆盐胆盐：抑制抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌；其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌；溴甲酚紫溴甲酚紫：pH指示剂指示剂，细菌产酸后，培养基即细菌产酸后，培养基即由原来的由原来的紫色变为黄色，紫色变为黄色，溴甲酚紫还有溴甲酚紫还有抑制抑制其其他细菌如芽孢杆菌生长的作用。他细菌如芽孢杆菌生长的作用。乳糖初发

7、酵试验（假定试验）乳糖初发酵试验（假定试验）接种量在接种量在1mL以上者，用以上者，用双料乳糖胆盐发酵管双料乳糖胆盐发酵管；1mL及及1mL以下者，用以下者，用单料乳糖胆盐发酵管单料乳糖胆盐发酵管；每一稀释度接种每一稀释度接种3管，置管，置(361)温箱内，培养温箱内，培养(242)h，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。可报告为大肠菌群阴性。如产气，按另外程序进行。如产气，按另外程序进行。大肠菌群阳性反应大肠菌群阳性反应乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管产酸产气现象 分离培养分离培养将产酸产气的发酵管培养物分别划线接种到将产酸产气的发酵管培养物分别

8、划线接种到伊红美蓝琼脂平板伊红美蓝琼脂平板上，置上，置(361)温箱内温箱内培养培养18-24h，挑取，挑取典型的菌落典型的菌落，并作革兰氏，并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。染色镜检和复发酵试验。分离培养分离培养伊红美蓝琼脂平板（伊红美蓝琼脂平板（EMB）：伊红伊红和和美蓝美蓝染料作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，这两种染料结合成复合物，使大肠菌群产生特征性菌落：a 深紫黑色，有金属光泽；b 紫黑色、不带或略带金属光泽；c 淡紫红色、中心颜色较深。伊红美蓝琼脂平板伊红美蓝琼脂平板特征性菌落特征性菌落 乳糖复发酵试验（证实试验乳糖复发酵试验（证实试验）目的目的：证明从乳糖初发酵试验呈阳

9、性反应的：证明从乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产酸产气。确能发酵乳糖产酸产气。乳糖复发酵试验（证实试验乳糖复发酵试验（证实试验）在在伊红美蓝琼脂平板伊红美蓝琼脂平板上，上，挑取可疑大肠菌群菌挑取可疑大肠菌群菌落落1-3个进行个进行革兰氏染色革兰氏染色。同时接种乳糖发酵。同时接种乳糖发酵管，置管，置(361)温箱内培养温箱内培养(242)h，观察产，观察产气情况。气情况。乳糖复发酵试验（证实试验乳糖复发酵试验（证实试验）作用机理同乳糖初发酵试验作用机理同乳糖初发酵试验凡乳糖发酵管产酸产气、革兰氏染色阴性无芽凡乳糖发酵

10、管产酸产气、革兰氏染色阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色阳性，即报凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色阳性，即报告为大肠菌群阴性。告为大肠菌群阴性。报告报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN的的检索表，报告每检索表，报告每100mL(g)食品中大肠菌群的食品中大肠菌群的最可能数最可能数(MPN)。大肠菌群最可能数大肠菌群最可能数(MPN)(MPN)检索表检索表阳性管数阳性管数MPNMPN个个/100mL(g)/100mL(g)阳性管数阳性管数MPNMPN个个/100mL(g)/100mL(g)1mL(

11、g)1mL(g)3 30.1mL(g)0.1mL(g)3 30.01mL(g)0.01mL(g)3 31mL(g)1mL(g)3 30.1mL(g)0.1mL(g)3 30.01mL(g)0.01mL(g)3 30 00 00 030301 10 00 040400 00 01 130301 10 01 170700 00 02 260601 10 02 21101100 00 03 390901 10 03 31501500 01 10 030301 11 10 070700 01 11 160601 11 11 11101100 01 12 290901 11 12 21501500 01

12、 13 31201201 11 13 31901900 02 20 060601 12 20 01101100 02 21 190901 12 21 11501500 02 22 21201201 12 22 22002000 02 23 31501501 12 23 32402400 03 30 090901 13 30 01601600 03 31 11301301 13 31 12002000 03 32 21601601 13 32 22402400 03 33 31901901 13 33 3290290大肠菌群最可能数大肠菌群最可能数(MPN)(MPN)检索表（续）检索表（续）阳性

13、管数阳性管数MPNMPN个个/100mL(g)/100mL(g)阳性管数阳性管数MPNMPN个个/100mL(g)/100mL(g)1mL(g)1mL(g)3 30.1mL(g)0.1mL(g)3 30.01mL(g)0.01mL(g)3 31mL(g)1mL(g)3 30.1mL(g)0.1mL(g)3 30.01mL(g)0.01mL(g)3 32 20 00 090903 30 00 02302302 20 01 11401403 30 01 13903902 20 02 22002003 30 02 26406402 20 03 32602603 30 03 39509502 21 1

14、0 01501503 31 10 04304302 21 11 12002003 31 11 17507502 21 12 22702703 31 12 2120012002 21 13 33403403 31 13 3160016002 22 20 02102103 32 20 09309302 22 21 12802803 32 21 1150015002 22 22 23503503 32 22 2210021002 22 23 34204203 32 23 3290029002 23 30 02902903 33 30 0240024002 23 31 13603603 33 31 1

15、460046002 23 32 24404403 33 32 211000110002 23 33 35305303 33 33 32400024000说明本表采用本表采用3个稀释度：个稀释度：1mL(g)、0.1mL(g)0.01mL(g)，每稀释度，每稀释度3管；管；表内所列检样量如改用表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)、0.1mL(g)，表内数字应相应降低，表内数字应相应降低10倍；倍；如改用如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)0.001mL(g)，表，表内数字相应增加内数字相应增加10倍；倍；依此类推。依此类推。实验样品及要求实验样品及要求检测食品：纯奶检测食品：纯奶稀释度：稀释度：1:1、1:10、1:100稀释液稀释液 结论结论 加入纯奶加入纯奶1:1、1:10、1:100稀释液的乳糖胆盐发稀释液的乳糖胆盐发酵管阳性管数分别为酵管阳性管数分别为0、1、1，查大肠菌群，查大肠菌群MPN检索表检索表所检测的消毒乳中大肠菌群所检测的消毒乳中大肠菌群MPN为为60个个/100mL产品不合格。产品不合格。