细胞因子检测课件.ppt

1、优点：优点：敏感、可靠；敏感、可靠；缺点：缺点：需长期饲养细需长期饲养细胞、检测耗时长、步胞、检测耗时长、步骤繁杂。骤繁杂。1不同的不同的CK具有不同的具有不同的生物学活性，选择生物学活性，选择CK独特的生物学活性，即独特的生物学活性，即可检测。可检测。细胞增殖细胞增殖/抑制实验抑制实验细胞病变抑制实验细胞病变抑制实验细胞毒实验细胞毒实验细胞趋化实验细胞趋化实验生物学检测法生物学检测法2利用抗体对抗原表位的利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。细胞因子的抗原性。ELISARIAFIAELISPOT。免疫学检测法免疫学检测法优点：优点：方便、迅速方便、迅速

2、缺点：缺点：价格昂贵，结价格昂贵，结果仅代表果仅代表CK的量而非的量而非活性，敏感性较低。活性，敏感性较低。3利用基因探针，检测特利用基因探针，检测特定细胞因子基因表达，定细胞因子基因表达，即即mRNA水平。水平。斑点杂交斑点杂交Northern印迹印迹细胞和组织原位杂交细胞和组织原位杂交RT-PCR。分子生物学检测法分子生物学检测法局限性：局限性：仅能检测基因表仅能检测基因表达情况，不能直接提供有达情况，不能直接提供有关细胞因子的浓度和活性，关细胞因子的浓度和活性，只用于机制探讨。只用于机制探讨。待检样品待检样品(细胞上清细胞上清)指示细胞（指示细胞（CTLL-2CTLL-2）IL-2IL-

3、2依赖细胞系依赖细胞系按不同稀按不同稀释度加入释度加入3737C C，16-2016-20小时小时加入加入3 3HTdRHTdR（1-51-5 CiCi）3737C C，4-64-6小时小时收集细胞收集细胞测定测定待检样品（细胞上清）待检样品（细胞上清）IFN-IFN-指示细胞（指示细胞（wishwish）按不同稀按不同稀释度加入释度加入3737C C，4 4小时小时3737C C，24-4824-48小时小时弃取上清，加入弃取上清，加入VSVVSV(水泡性口炎病毒水泡性口炎病毒)观察细胞病变（镜检或比色）观察细胞病变（镜检或比色）Using CFSE to track CML progeni

4、tor proliferationSDMSDM+GlivecCalculation of Proliferative Index(P.I.)CFSE-4 3 2 1 0The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells.It is useful for comparing quantity of cell division between cultures of the same cells und

5、ergoing different treatments.Cell Proliferation ELISA Kit,BrdU(colorimetric)Chromium-51(51Cr)release assays 计数受趋化细胞计数受趋化细胞趋化因子趋化因子细胞细胞趋化实验示意图趋化实验示意图微孔微孔滤膜滤膜 用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。可见的或可测定的。免疫标记技术免疫标记技术 高通量细胞因子检测高通量细胞因子检测vCBA(Cytometri

6、c Bead Array)是一种微珠多是一种微珠多用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、液、EDTAEDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。血浆、血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析策略，与传统的其采用夹心法分析策略，与传统的ELISAELISA分分析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的被测样本的浓度。此分析方法不受样

7、本量的限制，而且可以得到一个样本的多个数据。限制，而且可以得到一个样本的多个数据。Cytokine networkCBA原理示意图原理示意图v Lab Invest 2003,83:11311146 cytokine bead arrays(CBA)ELISPOT(酶联免疫斑点实验酶联免疫斑点实验)vELISPOTELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细胞因子。实验中每个斑点（胞因子。实验中每个斑点（spotspot）是激活的淋巴）是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域

8、，代表一个活性淋巴细细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗胞。它可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。原的反应能力。v优点：优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。可检测到百万分之一阳性细胞率可检测到百万分之一阳性细胞率;单细胞水平、单细胞水平、活细胞功能检测活细胞功能检测;操作简便，可进行高通量筛选。操作简便，可进行高通量筛选。1.特异性单抗包被在培养板孔底部；特异性单抗包被在培养板孔底部；2.封闭能结合单抗的其他部位；封闭能结合单抗的其他部位；3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞加入细胞及刺激

9、物培养，阳性细胞分泌的细胞因子被单抗捕获；分泌的细胞因子被单抗捕获；4.移出细胞，洗涤；移出细胞，洗涤；5.加入生物素标记的二抗；加入生物素标记的二抗；6.加入酶标链霉亲和素；加入酶标链霉亲和素；7.加入显色底物，在酶的催化分解下，加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；部的膜上形成斑点；8.斑点计数（可人工计数，也可用自斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，结果动读板仪计数），数据处理，结果分析。分析。ELISPOT应应 用用v 移植研究移植研究-allograft rejection-allograft

10、 rejection v 疫苗开发疫苗开发-亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 v Th0/Th1/Th2Th0/Th1/Th2细胞转换分析细胞转换分析 v 自体免疫研究自体免疫研究-免疫调节及免疫治疗研究免疫调节及免疫治疗研究 v 癌症研究癌症研究-肿瘤反应肿瘤反应T T细胞作用细胞作用 v 过敏机制探讨过敏机制探讨-IL-4-IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过敏机制之细胞因子的研究与过敏机制之细胞因子的研究 v 传染疾病研究传染疾病研究-Lyme disease,Chlamydia infections,-Ly

11、me disease,Chlamydia infections,Helicobacter pylori infections,HIV infections,multiple Helicobacter pylori infections,HIV infections,multiple sclerosis,sclerosis,等等 MediumPHAPeptide 1Peptide 21Peptide 47GzBHIV-peptide recall patient BIFN-HIV-peptide specific recall response shows dissociated product

12、ion of IFN-and GzBKleen T.et al,AIDS 2003,18:383-392ELISPOT 和和 ELISA的区别的区别ELISPOT ELISPOT 法源自法源自 ELISA ELISA，又突破传统，又突破传统 ELISA ELISA 法，是定量法，是定量 ELISA ELISA 技术的延伸和新的发展，它们最大的不同技术的延伸和新的发展，它们最大的不同:1.ELISA 1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量溶性蛋白总量(整体水平整体水平);ELISPOT);ELIS

13、POT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过斑点或通过ELISPOTELISPOT分析系统对斑点进行计数，分析系统对斑点进行计数，1 1个斑点代表个斑点代表1 1个细胞，从个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率（而计算出分泌该蛋白的细胞的频率（单细胞水平单细胞水平）；）；2.ELISPOT2.ELISPOT比比ELISAELISA更敏感。更敏感。ELISPOTELISPOT技术应用领域：自身免疫诊断和预后分析、器官技术应用领域

14、：自身免疫诊断和预后分析、器官移植后排斥反应的预测、过敏性疾病脱敏治疗的监测、疫移植后排斥反应的预测、过敏性疾病脱敏治疗的监测、疫苗和药品的研发与检测等。苗和药品的研发与检测等。胞内细胞因子的检测胞内细胞因子的检测LPS活化单核细胞内活化单核细胞内TNF-的测定的测定R1：淋巴细胞；：淋巴细胞；R2：单核细胞：单核细胞TNF-的诱生和检测的诱生和检测v主要由主要由单核单核/巨噬细胞巨噬细胞及其他多种细胞产生，能及其他多种细胞产生，能使杀伤肿瘤细胞使杀伤肿瘤细胞;vTHP-1THP-1(人单核细胞系人单核细胞系)在在LPSLPS(脂多糖脂多糖)刺激下可刺激下可分泌分泌TNF-TNF-;vL929

15、L929(小鼠成纤维细胞小鼠成纤维细胞)可被可被THP-1THP-1分泌的分泌的TNF-TNF-杀伤，且细胞的死亡率与杀伤，且细胞的死亡率与TNF-TNF-活性成正比活性成正比;v四甲基偶氮唑盐四甲基偶氮唑盐(MTTMTT)在活细胞线粒体的琥珀酸在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶的作用下，被还原呈脱氢酶的作用下，被还原呈蓝黑色蓝黑色的的MTT-MTT-甲瓒。甲瓒。离心收集离心收集培养上清培养上清加入加入加入四甲基偶加入四甲基偶氮唑盐氮唑盐(MTT)37C,5%CO2,LPS,18-24h放线菌放线菌素素D处理处理37C,5%CO2,18-24h37C,5%CO2,4-6h吸出上清，加入吸出上清，加入DMSO，测，测OD570TNF-的诱生和检测的诱生和检测谢谢！