第十二章色谱分析法课件.ppt

1、 色谱法是现代色谱法是现代分离分析分离分析的一种重要方法。的一种重要方法。各种色谱法如气相色谱、高效液相色谱、离子各种色谱法如气相色谱、高效液相色谱、离子色谱、超临界流体色谱等，以及色谱法与其他色谱、超临界流体色谱等，以及色谱法与其他技术联用，使色谱法成为生产和科研中解决复技术联用，使色谱法成为生产和科研中解决复杂混合物分离分析的重要手段之一。杂混合物分离分析的重要手段之一。第第12章章 色谱分析法色谱分析法o12.1 概述概述o12.2 气相色谱理论基础气相色谱理论基础o12.3 气相色谱法气相色谱法o12.4 高效液相色谱法高效液相色谱法o12.5 色谱分离方式的选择色谱分离方式的选择12

2、.1 概述概述一、色谱法简介一、色谱法简介1906年，俄国植物学家M.Tswett发表了他的实验结果：为了分离植物色素，他将含有植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在CaCO3颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，从而形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱色谱法(chromatography)。在此后的20多年里，几乎无人问津这一技术。到了1931年，德国的Kuhn等用同样的方法成功地分离了胡萝卜素和叶黄素，从此色谱法开始为人们所重视，相继出现了各种色谱方法。俄国植物学家茨维

3、特Tswett植物色素分离实验图示：l样 品：植物色素l固定相：CaCO3颗粒l流动相：石油醚 流动相石油醚混合色素叶绿素叶黄素胡萝卜素分离组分色谱柱固定相碳酸钙表1 色谱法的发展简史年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离用氧化铝和碳酸钙分离-,-,-胡萝卜素。色谱法受重视。胡萝卜素。色谱法受重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。最先使用薄层色谱法。Taylor,Ura

4、y用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气相色谱。液分配色谱；预言了气相色谱。1944Consden等等发明了纸色谱。发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段1952Martin,James从理论和实践方面完善了从理论和实践方面完善了气气-液分配色谱法。液分配色谱法。(1952诺贝尔奖诺贝尔奖)1956Van Deemter等等提出色谱速率理论，并应

5、用于气相色谱。提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型

6、离子色谱法。电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等等创立了毛细管电泳法。创立了毛细管电泳法。年代获奖学科获奖研究工作1937化 学胡萝卜素化学，维生素A和B1938化 学胡萝卜素化学1939化 学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化 学超铀元素的发现1955化 学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化 学胰岛素的结构1961化 学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学医学关于神经元触处迁移物质的研究化 学发现糖核苷酸及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化 学核糖核酸化学酶结构的研究生理学医学抗体结构的研究o190

7、6，俄国植物学家，俄国植物学家 M.Tswett 发明色谱法，色谱之父发明色谱法，色谱之父o1931，对液固吸附色谱的杰出贡献者库恩，分离出，对液固吸附色谱的杰出贡献者库恩，分离出60多种多种胡萝卜素，核黄素、维生素，获胡萝卜素，核黄素、维生素，获1938年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖o蒂塞利乌斯蒂塞利乌斯(Tiselius)因电泳分析和分析方法的研究，发现因电泳分析和分析方法的研究，发现血清蛋白组分，获血清蛋白组分，获1948年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖o1941，马丁，马丁(Martin)和辛格和辛格(Synge)创始分配色谱特别是纸创始分配色谱特别是纸色谱而共获色谱而共获1952年诺贝尔化

8、学奖年诺贝尔化学奖o氨基酸自动分析仪发明人氨基酸自动分析仪发明人S.穆尔穆尔(Stanford Moore)和和W.H.斯坦斯坦(William Howard Stein)，定量分析方法解决了有关，定量分析方法解决了有关氨基酸、多肽、蛋白质等复杂的生物化学问题，获氨基酸、多肽、蛋白质等复杂的生物化学问题，获1972年年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖1.色谱法的定义色谱法的定义 色谱法又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质(样品)与固定相和流动相之间的作用力(分配、吸附、离子交换等)的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次“平衡”，使各溶质达到相互分离。固定相：在色谱分离

9、中固定不动，对样品产生保留的一相。流动相：带动样品向前移动的另一相，与固定相处于平衡状态。二、色谱法的定义与分类二、色谱法的定义与分类o利用不同物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相作相对移动时，使这些物质在两相间进行反复多次分配，原来微小的分配差异产生了很明显的分离效果，按照先后顺序依次流出色谱柱。2.色谱法的分离原理色谱法的分离原理根据流动相的状态将色谱法分成四大类。表3 色谱法以流动相种类的分类色谱类型流动相主要分析对象气相色谱法气体挥发性有机化合物液相色谱法液体溶于水或有机溶剂的各种物质超临界色谱法超临界流体各种有机化合物电色谱法缓冲溶液、电场离子和各种有机化合物3.色谱法的

10、分类色谱法的分类1.按两相分子的聚集状态分类2.按固定相的固定方式分类平面色谱纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱 色 谱 填充柱色谱 毛细管柱色谱 分配色谱：利用分配系数的不同吸附色谱：利用物理吸附性能的差异离子交换色谱：利用离子交换原理空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同3.按分离机制分类流动相 固定相 类型液体 固体 液-固色谱液体 液体 液-液色谱气体 固体 气-固色谱气体 液体 气-液色谱液相色谱气相色谱 色谱过程是物质分子在相对运动的两相间分配平衡的过程。在混合物中，若两个组分的分配系数不等，则被流动相携带移动的速率不等，即形成差速迁移而被分离。如图所示。三、色谱过程与术语三、色谱过程与术

11、语1.色谱过程色谱过程o色谱过程的实质(1)色谱过程是吸附与解析的过程；(2)不同组分极性的差异导致吸附与解析的差异；(3)不同组分向前移动的过程是差异不断累积过程，是在动态中由量变到质变的过程。BAABBABBABABct流动相样品液色谱柱固定相检测器2.基本术语基本术语检测色谱分离后组分的响应信号对时间作图得到的曲线称为色谱图。色谱流出曲线AOAEGFH进样 空气峰C I DJtBh21h.6670h221/WW0tRRtt信号O0名词术语：色谱峰、基线、峰高h、标准偏差、峰底宽W、半峰宽W1/2、峰面积A；包含信息：tR；h或A；,W1/2,W。关系：W=4，W1/2=2.354，W=1

12、.699W1/2AOAEGFH进样 空气峰C I DJtBh210.607hh221/WW0tRRtt信号O02.基本术语基本术语2.基本术语基本术语AOAEGFH进样 空气峰C I DJtBh210.607hh221/WW0tRRtt信号O0保留值是色谱定性分析和色谱过程热力学特性的重要参数。（1）根据色谱峰的数目，可以判断试样中所含组分的最少个数；（2）根据色谱峰的保留值可以进行定性分析；（3）根据色谱峰高或面积可以进行定量分析；（4）根据色谱峰间距及其宽度，可对色谱柱的分离效能进行评价。从色谱流出曲线获得的信息：从色谱流出曲线获得的信息：o色谱分离的基本要求是实现混合物中各组分的分离。o

13、色谱分离的首要条件是相邻两组分的保留值存在一定的差别，两组分的色谱峰间距要足够远。另一个条件是色谱峰区域宽度要窄。这就涉及到色谱热力学和动力学。o在解决多元混合物分离问题时，不仅要求各组分间达到一定的分离度，还要求分离速度快，分离的组分多。12.2 气相色谱理论基础气相色谱理论基础1.分配系数(K)：色谱过程中，在流动相和固定相中的溶质分子处于动态平衡。平衡时组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度之比，称为分配系数。msccK 分配系数的物理意义：表示平衡态下，组分在固定相和流动相的浓度之比，也叫做分配平衡常数。其中，在吸附色谱中称为吸附系数(Ka)；在离子交换色谱中称为选择性系数(Ks)；

14、在凝胶色谱中称为渗透系数(Kp)。分配系数的差异是所有色谱分离的实质性的原因。一、塔板理论一、塔板理论（一）分配平衡（一）分配平衡o又称为分配比。是平衡状态下，组分在固定相(s)与流动相(m)中的质量之比。色谱柱的容量因子是溶质分子与色谱柱填料相互作用强度的直接量度，是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。-sssmmm000smsmRRmkmc VVmkKmcVVtttktt 2.容量因子容量因子(k)分配系数分配系数K和分配比和分配比k的关系：的关系：o分配系数不同的各组分具有不同的保留值，因而在色谱图上有不同位置的色谱峰。-0000Rms(1)V=V+K VRRRtttkttttk

15、3.色谱基本保留方程色谱基本保留方程1.塔板理论的基本假设：塔板理论的基本假设：（1）色谱柱是由一系列连续、等距的水平塔组成，在柱内每层塔板内部，组分能够在流动相和固定相两相中达到平衡。（2）流动相通过色谱柱呈间歇式前进运动，每次前进为一个塔板体积。（3）样品和流动相同时加在第一个塔板上，且样品垂直于前进方向的扩散(即纵向扩散)可以忽略。（4）分配系数在各塔板上是常数。（二）塔板理论（二）塔板理论塔板理论的这些假设，实际上是把组分在两相间的连续转移过程，分解为间歇地在单个塔板中的分配平衡过程，经过多次分配平衡后，分配系数小的组分先达到塔顶（即挥发性大的组分先流出色谱柱）。色谱柱的塔板数可高达几

16、千甚至几万，使被测组分在分配系数间有微小的差别时就可以得到分离。2.塔板理论的计算公式塔板理论的计算公式 理解：在tR一定时，W或W1/2越小(即峰越窄)，理论板数n越大，理论板高越小，柱的分离效率越高。有效理论塔板neff也同此理。因此，理论塔板数是评理论塔板数是评价柱效能的指标。价柱效能的指标。221/2221/2165.54165.54effeffRRRReffHLnHLHnttnWWttnWW 论论塔塔板板高高度度论论数数论论论论数数论论数数理：理塔板：有效理板高：理塔板：有效理塔板：3.塔板理论的优点和局限塔板理论的优点和局限优点：塔板理论是半经验性理论，在解释流出曲线的形状、浓度极

17、大点的位置、评价柱效高低等方面是成功的。局限：塔板理论的基本假设与事实不完全相符，它无法解释谱带扩展的原因，也无法解释色谱过程与流动相流速、柱内分子扩散传质过程以及色谱操作参数等动力学因素的关系。这些问题，在速率理论中得到了圆满的解决。为了克服塔板理论的缺陷，Van Deemter等在Martin等人的工作基础上，较完整地解释了速率理论。后来，Giddings等又作了进一步的完善。速率理论充分考虑了溶质在两相间的扩散和传质过程，更接近溶质在两相间的实际分配过程。当溶质谱带向柱出口迁移时，必然会发生谱带展宽。谱带的迁移速率的大小决定于流动相线速度和溶质在固定相中的保留值。同一溶质的不同分子在经过

18、固定相时，它们的迁移速率是不同的，正是这种差异造成了谱带的展宽。谱带展宽的直接后果是影响分离效率、降低检测灵敏度。所以，抑制谱带展宽就成了高效分离追求的目标。引起谱带展宽的主要因素有：(1)涡流扩散；(2)分子扩散；(3)传质阻力。这些因素都统一于Van Deemter方程中。二、速率理论二、速率理论Van Deemter方程方程min2BHACuuHABC 符号名 称单位H塔板高度cmA涡流扩散项cmB分子扩散系数cm2s-1C传质阻力系数 s u载气线流速cms-1图 范氏方程中各项对板高的贡献0tLu Van Deemter方程方程中各项的意义符号名称关系式备 注A涡流扩散项(多路径项)

19、A=2 dpdp：固定相颗粒平均直径；：涡流扩散因子，与填充的均匀性有关B/u分子扩散项(纵向扩散项)B=2 Dg：弯曲因子，反映固定相颗粒的空间结构。填充柱 0.5-0.7,空心柱 1；Dg ：组分分子在载气中的扩散系数Cgu气 相传质阻力项k：容量因子Clu液 相传质阻力项df：固定液液膜厚度，Cl：组分在固定液中的扩散系数gpgDkdkC222101.0()lflDdkkC222+18=引起谱带展宽的主要因素o涡流扩散o分子扩散o传质阻力o引起涡流扩散的原因是色谱柱内的多路径。溶质分子在前进过程中形成的这种紊乱类似于涡流的流动，所以称之为涡流扩散。A=2 dpo空心毛细管柱无多径相：A0

20、 ABC柱管壁 固定相 组分移行轨迹初始带宽谱带展宽流动相方向1.涡流扩散涡流扩散o引起分子扩散的原因是浓度梯度。分子扩散是溶质分子在移动方向上向前和向后的扩散，引起谱带展宽。它是由浓度梯度所引起。分子扩散引起的峰展宽由下式决定：分子扩散引起的色谱峰展宽示意图uDuBg2o式中B=2 Dg，为分子扩散系数；为弯曲因子或阻碍因子，填充柱=0.50.7，毛细管=1；Dg为溶质在流动相中的扩散系数；u 为流动相线速度。随着样品带在固定相中的移动，因分子扩散使样品带宽逐渐增加，相应得到的色谱峰就越来越宽而矮。2.分子扩散分子扩散o传质阻力系数C，是溶质在固定相中传质阻力系数(Cl)与流动相(气相)传质

21、阻力系数(Cg)之和：CClCg流动相传质阻力引起的扩散溶质分子要从流动相转移到固定相中，就要从流动相主体扩散到气液、气固、液液或液固界面，阻碍这一扩散过程的阻力称流动相传质阻力。流动相传质阻力引起的谱带展宽程度由下式决定：gpgDkdkC222101.03.传质阻力传质阻力固定相传质阻力引起的扩散溶质分子到达两相界面后，将继续扩散到固定相内部达到分配平衡，然后又返回到两相界面。溶质在这一移动过程中的阻力称固定相传质阻力。固定相传质阻力引起的谱带展宽由下式决定：lflDdkkC222)1(8结论：Van Deemter方程说明了色谱柱填充均匀程度、载体的性质与粒度、载气种类与流速、固定液层厚、

22、柱温等对柱效的影响，对分离条件具有指导意义。ggDrkkkC2022)1(241161lflDdkkC22)1(32uDdCDdCDdCuDCdHmpsmsfsmpmmdp2222Giddings方程(液相色谱)Golay方程(空心柱气相色谱)uCuCuBHlg三、色谱基本分离方程三、色谱基本分离方程 1.分离因子()：即相邻两个组分调整保留值之比，又称为相对保留值。2.分离度(R)：相邻两组分的色谱峰，其保留时间差与两峰峰底宽平均值之商。22112211RRRRtVkKtVkK 212112RRttRWW o分离度是综合性指标，是色谱柱的总分离效能指标。o色谱分析的目的就是要将混合物中的各组分分离，为了获得较好的准确度，一般规定两相邻峰的分离度 Rs1.5时，可认为两组分完全分离。3.色谱基本分离方程式色谱基本分离方程式2121212212eff21eff2,122,1-1()2n-nr-1=44r RRRRRRRRRttttttRWWWWttRt o上式即为色谱基本分离方程式，把分离度R和柱效能neff、柱选择性r2,1联系起来，为色谱分离条件的选择提供了理论依据。