第二章菌种选育3课件.ppt

1、第二章第二章 菌种的选育、保藏与复壮菌种的选育、保藏与复壮 v第一节、微生物工业用菌种v第二节、菌种的来源v第三节、菌种的选育v第四节、菌种保藏v第五节、菌种的提纯与复壮第一节、微生物工业用菌种第一节、微生物工业用菌种一、微生物工业对菌种的要求一、微生物工业对菌种的要求 微生物资源丰富，广布于土壤、水和空微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界中，其中土壤中最多。气等自然界中，其中土壤中最多。发展趋势：发展趋势：从野生型从野生型 变异株变异株 自然选育自然选育 代谢控制育种代谢控制育种 诱变育种诱变育种 基因工程定向育种基因工程定向育种（1）所需培养基易得，价格低廉；）所需培养基易得，价格

2、低廉；（2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）溶解氧、渗透压等）（3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短）生长速度和反应速度较快，发酵周期短（4）单产高）单产高（选择野生型、营养缺陷型或调节（选择野生型、营养缺陷型或调节突变株）突变株）微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：（5）抗病毒能力强）抗病毒能力强（6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好（7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒物活性物质

3、和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全素），保证安全二、工业上常用的微生物v微生物在工业上的用途很广，包括化工、医微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。石油化工等方面。v微生物的代谢产物多，已超过微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而多种，而用于大规模工业生产的不足用于大规模工业生产的不足100多种；微生物多种；微生物酶有近千种，而工业上用的不过酶有近千种，而工业上用的不过4050种。种。微生物具有巨大的潜力可挖掘。微生物具有巨大的潜力可挖掘。v工业上常用菌种举例：工业上常用菌种举例：1、常用的

4、细菌v 大肠杆菌 应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作枯草芽孢杆菌应用：生产淀粉酶2、酵母菌种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵红酵母、面包酵母。母、面包酵母。应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪。蛋白质、生产脂肪。啤酒酵母啤酒酵母红酵母红酵母面包酵母3、霉菌v曲霉属v应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶v应用：酱油、酱类（淀粉酶）应用：生产甲义丁二酸v米曲霉v应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲 毛 霉v应用：

5、可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作v根霉根霉v种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉v应用：酿酒青霉菌4、放线菌种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素 其他生物：其他生物：A:担子菌：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇担子菌：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视类生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖、抗癌药物的开发。，如多糖、抗癌药物的开发。近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中

6、的作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-葡萄葡萄糖苷酶糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。及两种糖类物质具有抗癌作用。B：病毒：病毒(virus)其特点如下：其特点如下：1.形体微小，体积比细菌小的多。形体微小，体积比细菌小的多。2.没有细胞结构，主要由核酸和蛋白质构成。没有细胞结构，主要由核酸和蛋白质构成。3.营寄生生活不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专营寄生生活不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。一性。人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome AIDS

7、）噬菌体（噬菌体（phage）是病毒的）是病毒的一种。一种。噬菌体在寄主细胞中的生噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分为吸附、浸入长繁殖过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。、增殖、成熟和释放。C：藻类（：藻类（alga）：培养培养螺旋藻螺旋藻，每公顷可收获，每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才吨，而种植大豆每公顷才可获可获4吨；吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。倍。还可通过藻类还可通过藻类将将CO转变为石油转变为石油，培养单胞藻或其他藻，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重得类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%，合成的油与重，合成的油

8、与重油相同，加工后可转变汽油、煤油等产品。还可减轻因工业油相同，加工后可转变汽油、煤油等产品。还可减轻因工业生产而大量排放生产而大量排放CO造成的温室效应。造成的温室效应。国外还有人从国外还有人从“藻类农场藻类农场”获取氢能获取氢能的报道，大量培养的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。藻藻 类类 工工 厂厂第二节第二节 菌种的来源菌种的来源一、微生物选择性分离方法一、微生物选择性分离方法v含微生物材料的选择v材料的预处理v所需菌种的分离v菌种的培养v菌种的选择和纯化1、含微生物材料的选择v微生物主要来自土壤v寻找已经适应苛刻环境压力的微生物类群

9、v例如：从盐场分离嗜盐链霉菌，从污泥中分离甲烷菌，从酒糟中分离酵母菌等。2、材料的预处理v通常采用热处理方法减少材料中的细菌数，但许多放线菌的繁殖体，孢子(如链霉菌)和菌丝片段(如红球菌)比G(-)细菌细胞耐热。加热虽然能减少细菌同放线菌的比例，但也常减少放线菌的数目。v采用膜过滤法浓缩水中的细胞。然后将滤膜置于培养基的表面，放置乃个小时后移去，或一直留在上面，如处理放线菌繁殖体含量很低的海水,有人先将样品离心然后才过滤。v收集在腐烂的稻草和其它植物材料中的嗜热放线菌孢子可在空气搅动下进行，并可用简单的沉淀室收集孢子。然后，用取样器将空气撞击在培养基的平板上，这样可以减少分离平板中的细菌数目。

10、v在分离前添加一些固体基质(如把几种基质加在土壤中)或洒些可溶性养分来强化培养基。v所谓诱饵技术是将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。有人曾广泛使用石腊棒技术来分离诺卡氏菌，从土壤中分离耐酸放线菌。近来,用花粉诱饵从土壤中分离出13株小瓶菌，其中有些新种或亚种。3、所需菌种的分离v分离效率取决于培养基的养分、分离效率取决于培养基的养分、pH、加入、加入的选择性抑制剂。的选择性抑制剂。v广泛应用的三种培养基即广泛应用的三种培养基即几丁质琼脂几丁质琼脂、淀淀粉一酪素培养基和粉一酪素培养基和M3培养基培养基。v因大多数放线菌都是嗜中性的，分离培养基的pH常在6.7-7.5之间。如

11、要分离嗜酸放线菌，pH宜降低到4.5-5.0。有人从碱性的加拿大土壤中分离出嗜碱链霉菌，它不能生长在低于pH 6.1-6.8的条件下，估计嗜碱性放线菌也可能存在于其它碱性环境中。v在分离培养基中广泛采用加入抗生素的方法，来增加选择性。4、菌种的培养v放线菌：放线菌：25-30。多数放线菌是好气的，因此必须保证。多数放线菌是好气的，因此必须保证足够的通气量；多数放线菌的最适生长温度为足够的通气量；多数放线菌的最适生长温度为23-37，高温放线菌的生长温度范围在高温放线菌的生长温度范围在50-65。v嗜热菌：嗜热菌：45-55。它能够产生耐热性蛋白质，在高温。它能够产生耐热性蛋白质，在高温条件下，

12、普通生物的蛋白质就会失活、变性，但是嗜热条件下，普通生物的蛋白质就会失活、变性，但是嗜热菌蛋白质不会变性，生命活动也不会终止。菌蛋白质不会变性，生命活动也不会终止。v嗜冷菌：嗜冷菌：4-10。嗜冷菌是指那些能在低于。嗜冷菌是指那些能在低于7时可以时可以生长繁殖的细菌，例如假单胞菌黄杆菌、产碱杆菌和色生长繁殖的细菌，例如假单胞菌黄杆菌、产碱杆菌和色杆菌属等。杆菌属等。5、菌落的选择v铺菌法 于分离平板上铺上一层单一的试验菌的办法用来测定各个菌落的抗生素生产能力。v复印平板法 将菌落复印在平板上的办法来研究它们对一系列试验菌的作用。这两种方法都有缺点。铺菌法会使所需要的菌落污染，并且只能在每个平板

13、上铺上一种试验菌。菌落复印平板法对不长孢子的链霉菌则不能使用，也不适用于游动细菌的筛选。二、重要工业微生物的分离方法 施加选择压力的分离方法：施加选择压力的分离方法：1、富集液体培养、富集液体培养：指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。要领：要领：给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌群生长的条件。e.g.供给特殊的基质或加入某些抑制剂。v注意注意：所需类型的菌株生长的结果，有时会改变培养基的性质，从而改变选择压力，使其他微生物生长。v解决办法解决办法：把富集培养物接种到新鲜的同一种培养基中可以重新建立选择压力，重复移植几次后，将富集培养物再接到固体培养基上。、固体培养基培养

14、、固体培养基培养：常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有所需酶的基质，以便促进酶产生菌的生长。e.g.碱性蛋白酶的分离用不同pH的土壤作为原始种子。土壤必须经过巴氏灭菌消毒，以减少不产孢子的微生物，然后铺在pH为910的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面。碱性蛋白酶的产生菌能消化平板的不溶性蛋白，产生一清晰圈。随机分离方法随机分离方法：1、制备一系列含有各种类型营养成分（生、制备一系列含有各种类型营养成分（生长限制因素）培养基；长限制因素）培养基；2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代谢物阻遏）；起分解代谢物阻遏）；3、加入缓冲液以减少、

15、加入缓冲液以减少pH的变化；的变化；4、确定含有所需的辅助因子、确定含有所需的辅助因子Co2+,Mn2+,Mg2+,Fe2+等。等。抗生素生产菌的筛选抗生素生产菌的筛选：把潜在的产生菌生长在含有试验菌的平板上，可以鉴定产生菌的抗微生物作用。也可以将微生物分离株生长在液体培养基中，检测其无细胞滤液的抗菌活性。药理活性化合物生产菌的筛选药理活性化合物生产菌的筛选：一种化合物如果能在体外抑制某种关键的人体酶，它就可能在体内具有药理作用。若将体外筛选出的活性化合物，再用动物作试验，可筛选出新的药理活性化合物生产菌。生长因子产生菌的筛选：生长因子产生菌的筛选：通过观察分离菌能否促进营养缺陷型（auxot

16、roph）的生长，便可检出生长因子产生菌。多糖生产菌的筛选多糖生产菌的筛选：从制糖工业的废水中可获得分离株，在适当的培养基中生长，可从菌落的粘液状外观识别这类产生菌。第三节、菌种的选育第三节、菌种的选育一、自然选育一、自然选育1、采样、采样采样对象采样对象 以以采集土壤采集土壤为主。一般园田土和耕作过为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以的沼泽土中，以细菌和放线菌细菌和放线菌为主，富含碳为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌酵母和霉菌较较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。象也可以

17、是植物，腐败物品，某些水域等。v采样季节：采样季节：以温度适中，雨量不多的以温度适中，雨量不多的秋初秋初为好。为好。v采土方式：采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面地面5-15cm处的土约处的土约10g，盛入清洁的牛皮，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。间、地点、环境条件等，以备查考。2、增殖培养、增殖培养 方法：方法：控制培养基成分控制培养基成分 控制培养条件控制培养条件 抑制不需要的菌类抑制不需要的菌类3、纯种分离纯种分离v划线法：简单、快捷。划

18、线法：简单、快捷。v稀释法：菌落单一均匀。稀释法：菌落单一均匀。接种针先以火焰灭菌法灭菌接种针先以火焰灭菌法灭菌 步骤一固体培养基四区划法接种法介绍如下：固体培养基四区划法接种法介绍如下：轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却 步骤二以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。步骤三更换一个新的无菌营养平板更换一个新的无菌营养平板 步骤四将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区此为第一菌区 。步骤五重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处

19、冷却。灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤六由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。图。步骤七步骤七重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。划出第三区，如右上图。步骤八重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。养平板，如右上图。步骤九 在营养平板上贴好标在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及作者姓名、菌种学名以及

20、培养基名称。培养基名称。步骤十步骤十需要使用的仪器需要使用的仪器震荡机震荡机 固体培养基的稀释涂抹接种法固体培养基的稀释涂抹接种法吸取准备好欲稀释的菌液吸取准备好欲稀释的菌液吸取充分均匀后的菌液吸取充分均匀后的菌液 取含有取含有 9mL9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将试管于震荡机上，使菌液混合均匀将试管于震荡机上，使菌液混合均匀 取出试管中的第一次十倍稀释菌液取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL1mL，加入另一个新的含加入另一个新的含9mL9mL无菌水的试管中。无菌水的试

21、管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。从最后稀释菌液中吸取从最后稀释菌液中吸取 0.1mL0.1mL菌液，菌液，置入准备好的无菌琼脂内。置入准备好的无菌琼脂内。将三角玻璃棒浸于酒精中将三角玻璃棒浸于酒精中 将三角玻璃棒在火焰上燃烧将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。数推算出菌液浓度。4 4、生产性

22、能的测定、生产性能的测定 一般采用两步法：一般采用两步法：初筛：以量为主初筛：以量为主 复筛：以质为主复筛：以质为主二、诱变育种二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。变。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂诱变剂物理：紫外线，快中子物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍生物：噬菌体生物：噬菌体 诱变育种的主要环节诱变育种的主要环节（1 1）以）以合适的诱变剂合适的诱变剂处理细胞悬浮液处理细胞悬浮液 诱变诱变（2 2）用）用合适的方法合适的方法淘汰负效应变异株，淘汰

23、负效应变异株，选出性能优良的正变异株选出性能优良的正变异株筛选筛选 按照生产的要求，根据生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选、而达到菌种诱变选育的目的。诱变原理：诱变育种一般采用物理、化学诱变剂使微生物DNADNA的碱基的碱基排列发生变化，以使排列错误的DNA模板形成异常的遗转信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞功能发生改变。原种（出发菌株）原种（出发菌株）纯化纯化斜面培养斜面培养完全培养完全培养基同步培养基同步培养离心洗涤离心洗涤玻璃珠震荡分散玻璃珠震荡分散过滤过滤单细胞或孢子悬浮液单细胞或孢子悬浮液 活菌计数活菌计数诱变处理诱变处理 诱变处理预备实验诱变处理预备实验

24、 处理液活菌计数处理液活菌计数平板分离平板分离 形态变异并计算其变异率形态变异并计算其变异率斜面培养斜面培养 初筛、复筛初筛、复筛 自然分离和再复筛自然分离和再复筛 保藏及扩大试验保藏及扩大试验诱变育种 出发菌株的选择 诱变剂的选择 诱变操作（包括诱变剂量的选择）突变株的筛选 突变高产菌的表现及筛选条件的配合 形态突变 高产突变 耐药性突变 营养缺陷型突变 结构类似物抗性突变v形态突变型形态突变型：指发生细胞形态变化或菌落形态变化的突变指发生细胞形态变化或菌落形态变化的突变型。型。v生化突变型生化突变型：没有形态效应的突变型，如营养缺陷型。没有形态效应的突变型，如营养缺陷型。v致死突变型致死突

25、变型：生活力下降的突变型。生活力下降的突变型。v条件致死突变型条件致死突变型：在某些条件下能成活，在另一些条件下在某些条件下能成活，在另一些条件下是致死的突变型。是致死的突变型。v营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株：由于代谢障碍而成为必须添加某种物由于代谢障碍而成为必须添加某种物质才能生长的突变株。质才能生长的突变株。v温度敏感性突变株温度敏感性突变株：可在某一温度下生长而在另一温度下可在某一温度下生长而在另一温度下不能生长的突变型。不能生长的突变型。出发菌株选择应考虑的问题出发菌株选择应考虑的问题v出发菌株的稳定性出发菌株的稳定性v选用具备优良特性的菌株选用具备优良特性的菌株v挑选对诱变剂敏感

26、的菌株挑选对诱变剂敏感的菌株v注意菌株的生理状态及生长发育时间注意菌株的生理状态及生长发育时间 出发菌株出发菌株 野生菌株野生菌株 自发突变后获得的高产菌株自发突变后获得的高产菌株 已经诱变过的菌株已经诱变过的菌株 考虑试验菌株的遗传背景：各种诱变剂有不同考虑试验菌株的遗传背景：各种诱变剂有不同的作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在的作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在DNADNA的某些特异部位上，多次反复用一种诱变因的某些特异部位上，多次反复用一种诱变因子易出现子易出现 “饱和饱和”或恢复突变现象，因此诱变或恢复突变现象，因此诱变时常采用多种不同的诱变因子或复合诱变因子。时常采用多种不同

27、的诱变因子或复合诱变因子。诱诱 变变 剂剂 的的 选选 择择菌悬液的制备菌悬液的制备 单细胞悬浮液：单细胞悬浮液：10106 6个个/mL/mL 孢子悬浮液：孢子悬浮液：10108 8个个/mL/mL诱变：预实验确定适宜的诱变条件诱变：预实验确定适宜的诱变条件筛选：选择合适的筛选方法筛选：选择合适的筛选方法紫外线的诱变育种紫外线的诱变育种v 紫外线诱变一般采用紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波紫外线杀菌灯，波长为长为2537A灯与处理物的距离为灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望

28、钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。为宜。v 被照射的菌悬液细胞数，细菌为被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个个ml左左右，霉菌孢子和酵母细胞为右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。进行搅拌，使照射均匀。v由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。和照射后的处理应在红灯下进行。三

29、、三、杂交育种杂交育种 两个不同基因型的菌株通过结合或原生质体两个不同基因型的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。有新性状的菌株。杂交可以使双亲的基因重新组合，形成各杂交可以使双亲的基因重新组合，形成各种不同的类型；基因重组可以将双亲控制不同种不同的类型；基因重组可以将双亲控制不同性状的优良基因结合于一体，或将双亲中控制性状的优良基因结合于一体，或将双亲中控制同一性状的不同微效基因积累起来，产生在各同一性状的不同微效基因积累起来，产生在各该性状上超过亲本的类型。该性状上超过亲本的类型。1、细菌的杂交、细菌

30、的杂交v 细菌的杂交行为是于细菌的杂交行为是于1946年首次在大肠杆菌年首次在大肠杆菌K-12菌株菌株中发现并证实的。中发现并证实的。v首先在大肠杆菌首先在大肠杆菌K-12菌株中诱发一个营养缺陷型菌株中诱发一个营养缺陷型(A-)、不能发酵乳糖不能发酵乳糖(Lac-)和抗链霉素和抗链霉素(SMr)以及对噬菌体以及对噬菌体T l敏感的突变体，可以写成敏感的突变体，可以写成A-B+Lac-SMrTs1；v另一菌株诱发成一个营养缺陷型另一菌株诱发成一个营养缺陷型(B-)，能发酵乳糖，能发酵乳糖(Lac+)，对链霉菌敏感，对链霉菌敏感(SMs)和抗噬菌体和抗噬菌体T l的突变体的突变体A+B-Lac+S

31、M sTr1。v这两个菌株各自都不能在基本培养基上生长，这两个菌株各自都不能在基本培养基上生长，如果把大约如果把大约105/ml浓度的上述两种菌株混合浓度的上述两种菌株混合在一起，并接种在在一起，并接种在基本培养基基本培养基上，则能长出少上，则能长出少数菌落；如果把上述两种菌株分别接种到一个数菌落；如果把上述两种菌株分别接种到一个特制的特制的U型管的两端去培养型管的两端去培养,中间用一片可以使中间用一片可以使培养液流通培养液流通,但不能使细菌通过的烧结玻璃隔但不能使细菌通过的烧结玻璃隔开开,那么在基本培养基上就不会出现菌落。那么在基本培养基上就不会出现菌落。这说这说明细胞的接触是导致基因重组的

32、明细胞的接触是导致基因重组的必要条件必要条件，即细菌通过接合完成了杂交行，即细菌通过接合完成了杂交行为。为。在鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、肺炎在鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、肺炎克氏杆菌、霍乱弧菌等许多细菌中也发现克氏杆菌、霍乱弧菌等许多细菌中也发现了接合现象，但是了接合现象，但是至今未在革兰氏阳性菌至今未在革兰氏阳性菌中发现接合现象中发现接合现象。2、放线菌的杂交育种、放线菌的杂交育种 v放线菌的基因重组于放线菌的基因重组于1955年至年至1957年首先在年首先在天蓝链霉菌天蓝链霉菌中发现，以后在其它科、属、种中中发现，以后在其它科、属、种中相继发现。相继发现。v现在常用的放线菌杂交方法主要有三种

33、：现在常用的放线菌杂交方法主要有三种：混合混合培养法、平板杂交法和玻璃纸转移法培养法、平板杂交法和玻璃纸转移法。国外在。国外在金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素产生菌的金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素产生菌的杂交育种方面都有过成功的报道。杂交育种方面都有过成功的报道。3、霉菌的杂交育种、霉菌的杂交育种v霉菌的杂交育种主要是通过体细胞的核融合和基霉菌的杂交育种主要是通过体细胞的核融合和基因重组，即通过准性生殖过程而不是通过性细胞因重组，即通过准性生殖过程而不是通过性细胞的融合。的融合。v霉菌的杂交育种的步骤为：霉菌的杂交育种的步骤为：第一第一 选择直接亲本。选择直接亲本。用来进行杂交的两个野生型菌

34、用来进行杂交的两个野生型菌株叫株叫原始亲本原始亲本。假设这种菌株是用来作为形成异。假设这种菌株是用来作为形成异核体的亲本核体的亲本,就叫就叫直接亲本直接亲本。作为直接亲本的遗传。作为直接亲本的遗传标记有多种，如营养突变型、抗药突变型、形态标记有多种，如营养突变型、抗药突变型、形态突变型等。突变型等。第二是异核体的形成第二是异核体的形成。v在基本培养基上在基本培养基上,强迫两株营养缺陷型互补营强迫两株营养缺陷型互补营养，则这两个菌株经过菌丝细胞间的吻合形养，则这两个菌株经过菌丝细胞间的吻合形成异核体。成异核体。第三是双倍体的检出第三是双倍体的检出 检出双倍体的方法有很多种，如用放大镜检出双倍体的

35、方法有很多种，如用放大镜观察异核体菌落表面，观察异核体菌落表面，如果发现有野生型颜色如果发现有野生型颜色的斑点和扇面，即可用接种针将其孢子挑出，的斑点和扇面，即可用接种针将其孢子挑出，进行分离纯化，即得杂合双倍体。进行分离纯化，即得杂合双倍体。或者将大量或者将大量异核体孢子分离于基本培养基平板上从中长出异核体孢子分离于基本培养基平板上从中长出野生型原养性菌落，将其挑出分离纯化，即得野生型原养性菌落，将其挑出分离纯化，即得杂合双倍体。杂合双倍体。第四是分离子的检出。第四是分离子的检出。v可以用选择性培养基筛选分离子，也可以将可以用选择性培养基筛选分离子，也可以将杂合双倍体单孢子分离于完全培养基平

36、板上，杂合双倍体单孢子分离于完全培养基平板上，培养至菌落成熟，检查大量双倍体菌落，在培养至菌落成熟，检查大量双倍体菌落，在一些菌落上有突变颜色（隐性标记）的斑点一些菌落上有突变颜色（隐性标记）的斑点或扇面出现，从每个菌落接出一个斑点或扇或扇面出现，从每个菌落接出一个斑点或扇面的孢子于完全培养基斜面上，培养后经过面的孢子于完全培养基斜面上，培养后经过纯化和鉴别即得分离子。纯化和鉴别即得分离子。四、原生质体融合四、原生质体融合步骤：步骤：v标记菌株的筛选：标记菌株的筛选：对两亲株要进行标记，以提高筛对两亲株要进行标记，以提高筛选率。选率。v原生质体的制备原生质体的制备：用相应的酶脱去菌体的细胞壁，

37、：用相应的酶脱去菌体的细胞壁，制得完整的原生质体。制得完整的原生质体。v原生质体的融合与再生原生质体的融合与再生：两原生质体在促融因子的：两原生质体在促融因子的存在下，发生融合，重建细胞壁，形成新的细胞。存在下，发生融合，重建细胞壁，形成新的细胞。v融合子的选择融合子的选择：在选择培养基上，通过两个亲本的：在选择培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而选择融合。遗传标记互补而选择融合。原生质体融合示意图细胞细胞壁壁溶细胞膜解酶原生质体融合 融合细胞营养细胞原生质体原生质体形成原生质体融合细胞壁再生2、特点及应用：、特点及应用：v原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交法原生质体间的杂交频率都明显高

38、于常规杂交法，霉菌与，霉菌与放线菌已达放线菌已达10-1 10-2，细菌与酵母已达，细菌与酵母已达10-510-6。v原生质体融合受接合型或致育型的限制较小，因此原生质体融合受接合型或致育型的限制较小，因此有利有利于不同种属间微生物的杂交。于不同种属间微生物的杂交。v已报道的丝状真菌已报道的丝状真菌种间种间的原生质体融合主要是曲霉属和的原生质体融合主要是曲霉属和青霉属；青霉属；属间属间原生质体融合主要在酵母中实现：热带假原生质体融合主要在酵母中实现：热带假丝酸母丝酸母饰针复膜孢酵母，酿酒酵母饰针复膜孢酵母，酿酒酵母彭贝裂殖酵母等。彭贝裂殖酵母等。v重组体重组体种类种类较多；较多；v遗传物质的遗

39、传物质的传递更完整；传递更完整；v采用温度、药物或紫外线照射灯处理钝化一方的亲采用温度、药物或紫外线照射灯处理钝化一方的亲株原生质体，再融合，可以株原生质体，再融合，可以提高筛选频率提高筛选频率；v可以把可以把原生质体融合与其他育种方法结合原生质体融合与其他育种方法结合起来，提起来，提高筛选效率。高筛选效率。五、五、DNADNA重组技术重组技术1.1.目标目标DNADNA片断的获得片断的获得2.2.与载体与载体DNADNA分子的连接分子的连接3.3.重组重组DNADNA分子引入宿主细胞分子引入宿主细胞4.4.从中选出所需重组从中选出所需重组DNADNA分子的宿主细胞分子的宿主细胞 基因重组质粒

40、的特点质粒的特点1、质粒的存在并非微生物生命活动必需。质粒的存在并非微生物生命活动必需。2、每个细胞中存在的质粒数称为该质粒的拷贝数。不同、每个细胞中存在的质粒数称为该质粒的拷贝数。不同类型的质粒其拷贝数各异，有严紧型和松弛型两种。类型的质粒其拷贝数各异，有严紧型和松弛型两种。3、质粒、质粒DNA分子常呈现分子常呈现三种三种形态；常见的一种是共价、形态；常见的一种是共价、闭环状闭环状DNA(CCC DNA)；其次是由于一条链有缺口而；其次是由于一条链有缺口而产生的开环产生的开环DNA(ocDNA)；第三种是由双环分子两段；第三种是由双环分子两段均断裂而产生的线性均断裂而产生的线性DNA。作为载

41、体的质粒的要求v能自主复制能自主复制v有明显筛选标记有明显筛选标记v有内切酶酶切位点有内切酶酶切位点v以多拷贝形式存在以多拷贝形式存在v含有启动子，有利于外源基因表达含有启动子，有利于外源基因表达v能在宿主中稳定的遗传能在宿主中稳定的遗传质粒质粒DNADNA的提取方法的提取方法v细菌培养和质粒扩增；细菌培养和质粒扩增；v细菌的收获和裂解；细菌的收获和裂解；v质粒质粒DNA的提取。的提取。重组重组DNADNA中常用的工具酶中常用的工具酶v限制性核酸内切酶：平头连结（不常限制性核酸内切酶：平头连结（不常用）、黏端连结（常用）用）、黏端连结（常用）vDNA连接酶连接酶vDNA聚合酶聚合酶v逆转录酶等

42、逆转录酶等限制性内切酶的剪切方式限制性内切酶的剪切方式宿主细胞必须符合以下条件宿主细胞必须符合以下条件v对载体的复制和扩增没有严格的限制；对载体的复制和扩增没有严格的限制；v不存在特异的内切酶体系降解外源不存在特异的内切酶体系降解外源DNADNA；v在重组在重组DNADNA增殖过程中，不会对它进行修饰；增殖过程中，不会对它进行修饰；v重组缺陷型，不会产生体内重组；重组缺陷型，不会产生体内重组；v容易导入重组容易导入重组DNADNA分子；分子；v符合重组符合重组DNADNA操作的安全标准。操作的安全标准。重组重组DNADNA导入宿主菌导入宿主菌v 体外连接的重组体外连接的重组DNADNA分子必须

43、导入适当的受体分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组采用的载体的性质，将重组DNADNA分子导入受体分子导入受体可有不同的方法。可有不同的方法。1 1、转、转 化化v指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态即容易接受外源感受态即容易接受外源DNADNA的状态，然后利用短的状态，然后利用短暂热休克使暂热休克使DNADNA导入细菌宿主中。导入细菌宿主中。v此外还可用电穿孔

44、法转化细菌，它的优点是操作简此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。便、转化效率高、适用于任何菌株。2 2、转染和感染、转染和感染v 利用噬菌体利用噬菌体DNADNA作为载体时可经两种方式导作为载体时可经两种方式导入受体菌。入受体菌。v一种是感染，即在体外将噬菌体一种是感染，即在体外将噬菌体DNADNA包装成病包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。毒颗粒，然后使其感染受体菌。v另一种方式是转染，即在另一种方式是转染，即在DNADNA连接酶作用下使连接酶作用下使噬菌体噬菌体DNADNA环化，再象重组质粒一样地转化进环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常

45、把以噬菌体受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNADNA为载体构为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。3 3、重组克隆的筛选与鉴定、重组克隆的筛选与鉴定 v基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。v通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。或表达该基因的产物。第四节、菌种

46、保藏第四节、菌种保藏v工业微生物菌种保藏与其他目的的菌种保藏要工业微生物菌种保藏与其他目的的菌种保藏要求有所不同。求有所不同。v工业微生物菌种保藏，工业微生物菌种保藏，是要使菌种生产能力和是要使菌种生产能力和与生产工艺相适应的优良性状保持稳定，力求与生产工艺相适应的优良性状保持稳定，力求把衰退现象推迟减缓到最低限度。把衰退现象推迟减缓到最低限度。1、菌种保藏原理v菌种保藏共同的目标菌种保藏共同的目标是把菌株的优良性状保存是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。下来，防止退化、死亡或杂菌污染。v保藏的一般程序是选取优良的纯菌种，最好是保藏的一般程序是选取优良的纯菌种，最好是用其分生

47、孢子或芽孢等休眠体，在其休眠和停用其分生孢子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。止生长的条件下保藏。v如将菌种如将菌种处于低温、干燥、无氧和缺乏营养处于低温、干燥、无氧和缺乏营养的的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。在低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。在在低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。可能使细胞死亡。快速降温，胞内很快形成冰晶，胞内外渗透快速降温，胞内很

48、快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。v低温保藏法 v低温定期移植法 v石蜡油低温保藏法 v干燥保藏 v甘油管保藏法 v真空冷冻干燥法 v液氮超低温保存 现行的菌种保藏方法有下列诸种:一、低温保藏法 v这是一种常用的简便方法。一般的这是一种常用的简便方法。一般的斜面孢子、液斜面孢子、液态孢子、斜面种子以及用麸皮、大米、小米或碎态孢子、斜面种子以及用麸皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子玉米制成的孢子，可以放在，可以放在44冰箱内保藏，一冰箱内保

49、藏，一般不超过般不超过1 12 2个月个月为宜。为宜。v本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的水平活本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的水平活性下，这对保藏株的生产性状是不利的，因此，性下，这对保藏株的生产性状是不利的，因此，生产菌种一般不采用此法保藏。生产菌种一般不采用此法保藏。二、低温定期移植法 v把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，定期移植，把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，定期移植，一般一般3 36 6个月移植一次个月移植一次(视菌种特征而定视菌种特征而定)。也可以。也可以用用穿刺培养穿刺培养。v穿刺培养是将含穿刺培养是将含0.60.60.80.8的琼脂培养基装试管的琼脂培养基装试

50、管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆大肠杆菌可保藏菌可保藏2 2年以上不发生明显变异年以上不发生明显变异。斜面定期移植与穿刺移植法有其斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷缺陷:v即容易发生遗传变异；即容易发生遗传变异；v连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌易于污染杂菌v因此，一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用因此，一