第9章白细胞血型课件.ppt

1、1白白 细细 胞胞 血血 型型第 九 章2白细胞抗原白细胞抗原1、红细胞血型抗原：如A、B、H、Lea、Leb 等。2、白细胞特有抗原：如CD4、CD8等。3、人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）：与其它组织细胞共有的抗原。首先在白细胞表面被发现白细胞表面含量最高 白细胞是研究这种抗原的最好材料3HLAHLA研究简史研究简史1958年，Dausset确立了人类第一个白细胞抗原Mac，即现 在所称的HLA-A2抗原，标志着HLA研究的开始。1958年，Payne 和van Rood各自分别发现某些经产妇血清 中含白细胞抗体，抗体发生率随妊娠次数增加而 增加，为

2、寻找白细胞抗体提供了一条有效途径。41962年，Janvan Rood用统计学方法，借助电子计算机分 析白细胞抗血清的特异性，发现4a/4b双等位基 因，即现在的Bw4和Bw6抗原；之后，补体依赖的细胞毒试验被引人白细胞抗原 检测，Terasaki又将这一技术微量化，建立了微 量淋巴细胞毒试验。HLAHLA研究简史研究简史51964年,英国学者Walter Bodmer报告了LA1、LA2 和 LA3，即HLA-A1、A2和A3抗原，奠定了HLA分型的基础;在Walter Bodmer 和Julie Bodmer的努力之下，国 际主要组织相容性工作小组和国际组织相容性工作 讨论会应运而生;召开

3、了第一届“国际组织相容性工作讨论会”;NIH成立HLA血清库，开展国际间的HLA抗血清交换。HLAHLA研究简史研究简史6届数 年份 主 要 内 容 第一届 1964年 世界各国实验室互相交换试剂，共同分析实验结果，统一方法与命名，Terasaki建立微量淋巴细胞毒试验作为白细胞分型技术 第二届 1965年 确认了HLA是人类组织相容性抗原；开始研究白细胞配型与皮肤、肾移植的关系 第三届 1967年 检出了6个白细胞抗原，开始了HLA与疾病的关联性研究；世界卫生组织正式使用HL-A命名；临床证明HLA配型能改善移植器官的存活 第四届 1970年 证实了HLA-A、B座位的存在，检出21种HLA

4、特异性 第五届 1972年 研究了HLA的群体遗传学，确定HLA由两条多肽链组成，HLA复合物位于人类第6号染色体上 第六届 1975年 确定了HLA-C和HLA-D座位，用血清学方法检出B细胞抗原 历届国际组织相容性抗原研讨会主要内容历届国际组织相容性抗原研讨会主要内容 7第七届 1977年 确定了HLA-DR座位 第八届 1980年 确定了92种HLA抗原，分别位于HLA-A.B.C.D和DR等5个座位，开始接受单克隆HLA抗体 第九届 1984年 确定了124种HLA抗原，及HLA-DP.DQ座位 第十届 1987年 确定了135种HLA抗原，开始建立HLA类的分子生物学分型技术 第十一

5、届 1991年 确定了146种HLA抗原，建立了HLA II类的PCR-SSCP分型标准，并明确今后凡确定新的血清学特异性，均需有DNA序列分析及氨基酸序列分析的资料 第十二届 1996年 研究HLA在DNA水平的变异及其免疫学功能，建立了HLA I类分子生物学分型方法(续表)81999年,在人类基因组计划工作草图完成之际,国际MHC 测序协作小组在著名Nature杂志上公布了人类 MHC基因参考序列图。HLAHLA研究简史研究简史9(续表)届数 年份 主 要 内 容 第十三届2002年进一步研究HLA在DNA水平的变异及其生物学功能，建立了标准化HLA DNA测序的分型方法第十四届2005年

6、讨论HLA在人类学及相关疾病领域中的应用第十五届2008年探讨HLA在造血细胞移植中的作用与意义 国际主要组织相容性工作小组（International Histocompatibility Working Group，IHWG）http:/www.ihwg.org10pHLA是人的主要组织相容性抗原 在不同种属或同种不同系的动物个体间进行正常组织或肿瘤移植会出现排斥，它是供者与受者组织不相容的反映。排斥反应是一种免疫反应，是由细胞表面的同种异型抗原诱导的。移植抗原或组织相容性抗原：代表个体特异性的同种抗原。主要组织相容性抗原：在组织相容性抗原中，能引起强而 迅速排斥反应的抗原。HLAHLA抗

7、原抗原11p HLA抗原有两类：HLA-类抗原和HLA-类抗原。HLAHLA抗原抗原12p HLA抗原有两类：HLA-类抗原和HLA-类抗原。HLAHLA抗原抗原存在于细胞表面跨膜蛋白质，异二聚体蛋白三级结构的相似之处：抗原结合部位均由8条反向平行的折叠链和2 条反向平行的螺旋链组成，称为肽结合槽,具有多态性的氨基酸残基位于此槽的底部。13HLAHLA抗原抗原p用一些物理或化学方法，如酶、去污剂、超声波可使HLA抗原与细胞膜分离，溶解在水溶剂中。pHLA抗原一旦从细胞膜上除去后，活细胞会在6个小时内重新合成这些抗原。14HLAHLA抗原抗原p 凡能使蛋白质变性的理化因素都会使HLA抗原发生不可

8、逆的变性，如50%尿素、90%酚、酒精、热、pH4或pH9，以及有机溶剂等。pHLA的抗原活性受机体生理周期，病理变化，激素水平改变以及使用某些药物的影响而变化。15p分布HLA-HLA-类抗原类抗原几乎存在于所有的有核细胞表面，不同细胞上的抗原分子多寡不同：以淋巴细胞上的密度最高；正常情况下，心肌细胞和肝细胞HLA抗原极少或没有。16p分布HLA-HLA-类抗原类抗原成熟红细胞上没有HLA-A、B、C，幼稚红细胞却有，年轻红细胞上有少量HLA抗原。血浆中有可溶性HLA-类抗原，可能是细胞膜代谢所致。血小板除自身带有HLA-类抗原外，还可以从血浆中吸附可溶性HLA抗原。17o 结构：由重链和轻

9、链两条多肽链构成，以非共价键相连接。重链（链）:HLA 类DNA分子编码 350个氨基酸，45KD 3个含90个氨基酸的结构域,1,2,3 3很恒定，2和1有高度多态性 轻链（m）：2微球蛋白 编码基因位于15号染色体上 约由100个氨基酸组成，无多态性HLA-HLA-类抗原类抗原18HLA-I类抗原可分为四个区：HLA-HLA-类抗原类抗原氨基端胞外多肽结合区胞外免疫球蛋白样区胯膜区胞浆区19氨基端胞外多肽结合区：1和2。氨基酸序列呈螺旋状排列，形成凹槽，为抗原决定槽。类抗原中的抗原决定槽两端是封闭的，只能容纳、提呈89个氨基酸的短肽。决定HLA-I类抗原多态性的所有氨基酸也都位于凹槽边或底

10、部。HLA-I类抗原可分为四个区：HLA-HLA-类抗原类抗原20HLA-类分子抗原结合区的三维图21胞外免疫球蛋白样区：3和Bm。3很恒定，与免疫球蛋白的恒定区具有同源性。Bm游离在细胞外，与1、2和3的相互作用对维持类抗原分子天然构型的稳定性有重要意义。胯膜区：氨基酸残基形成螺旋状穿过浆膜的脂质双层，将类抗原分子固定在膜上。胞浆区：位于胞浆中，可能与细胞内外的信号传递有关系。HLA-I类抗原可分为四个区：HLA-HLA-类抗原类抗原22肽结合区免疫球蛋白样区跨膜区胞浆区HLA-I类抗原结构示意图1 2323p分布 HLA-类抗原的分布远不如I类抗原广泛，主要分布于单核细胞，树突状细胞等具有

11、吞噬功能的细胞、以及B细胞、活化T细胞、肿瘤细胞等。大多数骨髓分化细胞也具有HLA-类抗原。HLA-HLA-类抗原类抗原24p结构：由和两条链构成，以非共价键连接。HLA-HLA-类抗原类抗原链：分子量为3335Kd HLA-类基因编码 2个结构域，1与2链：分子量为2530Kd HLA-类基因编码 2个结构域，1与225p结构HLA-HLA-类抗原类抗原类抗原的多态性是由结构域1和1所决定。HLA类抗原分子中的抗原决定槽两端是开放的。因此，类抗原分子能够容纳、提呈1524个氨基酸的长肽。26HLA-II类分子抗原结合区的三维图27肽结合区免疫球蛋白样区跨膜区胞浆区HLA-类抗原结构示意图2

12、12128 HLAHLA基因基因p编码主要组织相容性抗原的基因位于同一染色体片段上，形成一组紧密连锁的基因群，称为主要组织相容性复合体 p所有研究过的脊椎动物中都存在结构与功能相似的MHC遗传区域。小鼠：H-2；猪：SLA；人：HLA系统29p HLA基因位于人6p21.31。p 参考序列长3600kb，占整个人类基因组全部碱基序列的0.12%。p 是一个由一系列紧密连锁的基因座所组成的复合遗传系统。HLAHLA基因基因30pHLA区域内的基因座根据其编码HLA分子的分布、多态性与功能不同分为三个区：HLA-类基因区：约1600 2000kb，在复合体中位于远离着 丝点的一端，产物是HLA-I

13、类抗原分子。HLA-类基因区：约1000 1200kb，在复合体中位于近着丝 点一端，其产物是HLA-II类抗原分子。HLA-类基因区：居中，约400 1000kb，产物为补体成分、细胞因子等。HLAHLA基因基因3132HLA-IHLA-I类基因区类基因区 p经典HLA-I类基因(classical class I gene,HLAIa)p非经典HLA-I类基因(non-classical class I gene,HLA-Ib)pMIC基因p假基因33经典经典HLA-IHLA-I类基因类基因p 经典HLA-I类基因是指三个最早发现的功能位点,HLA-A,HLA-B和HLA-C.p HLA-

14、Ia基因均具有高度多态性。HLA-A HLA-B HLA-C 等位基因数量（2000年）207 412 100p 每个等位基因均编码经典I类抗原分子的重链。34非经典非经典HLA-IHLA-I类基因类基因o 包括HLA-E、F、G位点o HLA-Ib基因多态性有限o 编码产物分布局限35HLA-E基因 已命名的等位基因有6个。细胞膜表面低表达HLA-E分子,但在胎盘滋养层有较高表达。HLA-E分子是NK细胞抑制性受体CD94/NKG2的特异性配体，在免疫调节中起重要作用。非经典非经典HLA-IHLA-I类基因类基因36HLA-G基因 基因结构与HLA-Ia相似,已被正式命名的等位基因14个。仅

15、表达于与母体组织直接接触的胎儿滋养层细胞上,而这些细胞不表达经典的I类与类抗原。HLA-G分子可能是NK细胞抑制性受体KIRZDL4的配体,在母胎耐受中起重要作用。非经典非经典HLA-IHLA-I类基因类基因37MICMIC基因（基因（HLA-IHLA-I相关基因）相关基因）五个基因：A、B、C、D、EMICA和MICB为功能基因MIC C,MIC D,MIC E为假基因 MICA基因 具有高度多态性（51个等位基因）与HLA-B基因之间存在高度连锁不平衡。MICA分子是NK细胞抑制性受体NKG2D的配体。38主要位于HLA-A基因附近因有突变而没有产物表达假基因假基因39HLA-IIHLA-

16、II类基因区类基因区p 经典经典HLA-IIHLA-II类基因：类基因：DR、DQ、DPp 非经典非经典HLA-IIHLA-II类基因：类基因：DM，DO,TAP,LMP40pDR1个DRA基因+9个DRB基因（DRB1 DRB9）DRB1是II类区域中多态性最丰富的基因 (等位基因:271个)DRA基因编码DR分子重链（链），DRB基因编码DR分子的链,与DRA编码的链共同组成由血清学方法检出的DRI一DR18抗原特异性。经典经典HLA-IIHLA-II类基因类基因41不同DR单倍型中DRB基因的排列组合B基因含有几种不同的基因重排。DRB区域的结构和长度在不同的单倍型中有所不同。经典经典H

17、LA-IIHLA-II类基因类基因42pDQ两对DQA、DQB基因：DQA1和DQA2、DQB1和DQB2DQA1和DQB1为功能基因，编码DQ链和DQ链，构成DQ分子；DQA1和DQB1具有高度多态性：已被正式命名的DQA1等位基因有20个,DQB1等位基因45个。DQA2、DQB2为假基因，无表达产物经典经典HLA-IIHLA-II类基因类基因43pDP有两对DPA、DPB基因。DPA1、DPB1为功能基因，编码DP分子的、链。DPA2和DPB2为假基因,无产物表达。经典经典HLA-IIHLA-II类基因类基因44非非经典经典HLA-IIHLA-II类基因类基因p DM含2个DM基因，即D

18、MA、DMBDMA基因和 DMB基因具有多态性（DMA：4个等位基因，DMB：6个等位基因）。DM编码的蛋白分子与DR分子结构相似DM分子在外源性抗原递呈中起重要作用45pLMPLMP2基因和LMP7基因编码低分子量多肽（LMP）LMP将被处理的内源性蛋白质切割成小片段的肽，供HLA分子结合。非经典非经典HLA-IIHLA-II类基因类基因46TAP1基因和TAP2基因TAP基因具多态性编码抗原肽转运子（transporter associated with antigen processing，TAP），TAP分子属ABC转运体超家族成员，主要功能是将LMP酶解后的内源性抗原肽选择性的转运到

19、内质网中，与新合成的I类分子结合。pTAP非经典非经典HLA-IIHLA-II类基因类基因47HLA-IIIHLA-III类基因区类基因区p 人类基因组中基因密度最大的区域 补体基因C2、C4、Bf TNF、LTA、LTB基因 21-羟化酶基因 热休克蛋白基因：48HLA基因定位与基因结构49DPw1 DQ2 DR1 B5 Cw1 DPw1 DQ2 DR1 B5 Cw1 A1A1DPw2 DQ3 DR3 B7 Cw2 DPw2 DQ3 DR3 B7 Cw2 A2A2DPw3 DQ7 B8 Cw3 DPw3 DQ7 B8 Cw3 A3A3II类区 2 2m m 第15号染色体B C AB C A

20、HLA抗原表达HLAHLA基因基因I类区50多态性多态性51HLA-A697HLA-DRA3HLA-B1109HLA-DRB1603HLA-C381HLA-DRB2987HLA-E9HLA-DQA134HLA-F21HLA-DQB195HLA-G36HLA-DPA127MICA65HLA-DPB1131MICB30HLA-DMA4HLA-DMB7HLA-DOA12HLA-DOB9 类合计类合计2348类合计类合计1012WHO命名委员会正式命名的HLA等位基因数(2008年7月)52多态性多态性p在HLA区的每个基因座位上都有许多等位基因，等位基因之间的差别是由于核苷酸替换产生。p核苷酸的替换

21、在DNA水平上产生了单碱基多态性，可对应地导致蛋白质氨基酸序列中氨基酸替换，产生独立的抗原特异性。p一些等位基因，由于其核苷酸的替换产生的蛋白质氨基酸序列未变或改变并未明显影响到蛋白质抗原表位结构，未产生新的抗原特异性。53p HLA系统多态性的意义多态性多态性保证了机体对各种病原体产生合适的免疫反应以维持机体稳定性，对维持种属的生存和延续具有重要的生物学意义。HLA系统成为一个极好的人类遗传学标记。给组织移植过程中寻找配型合适的供体带来很大的困难。54HLAHLA基因基因基因密度最高的区域，在3.6Mb区域内共确认了224个基因,平均16kb一个基因；免疫功能相关基因最密集、最多的一个区域，

22、128个功能基因中39.8%的基因产物具有免疫功能；多态性最丰富的区域；55p世界卫生组织对HLA的命名包括基因命名与抗原特异性命名两个方面。p HLA遗传区域中的座位:以大写字母表示 如 A、B、C、DR、DP、DQHLAHLA命名命名 56p抗原特异性：HLAHLA命名命名 用数字表示HLA-A、B基因座上的抗原以发现先后秩序排列，因此HLA-A、B座位上的抗原特异性编号不重叠。例如,A：1、2、3、9、10、11等，B:5、7、8、11、13等。其他座位上的抗原特异性编号从1开始。为防止与补体组分命名相混淆，HLA-C抗原特异性以Cw为字首命名。57p抗原特异性：HLAHLA命名命名 随

23、着对HLA抗原研究的深入，HLA命名在不断修改。一些原来命名的抗原特异性可被进一步细分。先前命名的特异性称为宽特异性，分解后的抗原称为窄特异性或亚型。原来的宽特异性用括弧注明。例如：HLA-A23（9）和HLA-A24（9）HLA-B60（40）和HLA-B61（40）58p抗原特异性：HLAHLA命名命名 抗原特异性不断在被合并HLA 类基因座HLA 类基因座类抗原类等位基因类抗原 类等位基因91年961183914895年752133325659p基因HLAHLA命名命名 HLA基因命名一般以4位数字表示前2位数字表示对应最相近的HLA抗原特异性，后2位数字则用于表示亚型的等位基因。如：A

24、*0101和A*0102，均表示能用血清学方法检出的A1抗原的等位基因，但它们DNA编码的序列不同，产物的HLA特异性存在细微差别。60p基因HLAHLA命名命名 如果出现第5位数字，则代表“沉默取代”，即该基因中虽发生了个别碱基的替换，但新密码子与原密码子属简并密码，不影响所编码的氨基酸序列。如：A*31011与A*31012，二者DNA序列不同，但编码的A31抗原的氨基酸序列均相同。第6、7位数字代表相应的启动子(包括内含子或侧翼区等)序列的多态性，如DRB4*0101102。61p基因HLAHLA命名命名 末尾加英文字母N表示无效等位基因或不表达基因。如DR B4*0101102N 在不

25、能区分等位基因时，可允许取最前面的2位或4位数字表示该HLA的特异性。如目前已检出17个A2等位基因，如果不能确定是哪个等位墓因，则可写作A*02；62HLAHLA的遗传的遗传HLA属常染色体共显性遗传 人类HLA每个基因座上有众多等位基因，故多数个体是HLA杂合子。每个HLA基因座的两个等位基因表达一对抗原，组成了个体该基因座的表型。例如HLA-A1，2。p共显性遗传63表型HLA-A1,2HLA-A1,2；B5,7B5,7；Cw1,2Cw1,2；DR1,3DR1,3；DQ2,3DQ2,3；DP1,2DP1,2单倍型 HLA-A1HLA-A1，B5B5，Cw1Cw1，DR1DR1，DQ2DQ

26、2，DP1DP1基因型HLA-A1,B5,Cw1,DR1,DQ2,DP1HLA-A1,B5,Cw1,DR1,DQ2,DP1/A2,B7,Cw2,DR3,A2,B7,Cw2,DR3,DQ3,DP2 DQ3,DP2 HLAHLA的遗传的遗传 pHLA的表型和基因型64表型与基因型 HLA-A2,11HLA-A2,11；B13,44B13,44 A2,B13/A11,B44 A2,B44/A11,B13 A2,B13/A11,B44 A2,B44/A11,B13 HLA-A11,-HLA-A11,-；B13,44B13,44 A11,B13/A11,B44 A11,B13/A-,B44 A-,B13

27、/A11,B44 A11,B13/A11,B44 A11,B13/A-,B44 A-,B13/A11,B44 HLA-A11,-HLA-A11,-；B13,-B13,-A11,B13/A11,B13 A11,B13/A-,B13 A11,B13/A11,B-A11,B13/A11,B13 A11,B13/A-,B13 A11,B13/A11,B-A11,B13/A-,B-A-,B13/A11,B-A11,B13/A-,B-A-,B13/A11,B-HLAHLA的遗传的遗传 65A2,30;B13,38 A11,24;B8,27A2,30;B13,38 A11,24;B8,27 A2A2 A30

28、A30A2A2 A30A30B13B13 B38B38B38B38 B13B13A11A11 A24A24A11A11 A24A24 B8B8 B27B27B27B27 B8B8A2 A2 A11A11B13B13 B8B8A2 A2 A24A24B13B13 B27B27A30A30 A11A11B38 B38 B8B8 A2,11;B8,13 A2,11;B8,13 A2,24;B13,27 A2,24;B13,27A30 A30 A24A24B38 B38 B27B27 A11,30;B8,38 A11,30;B8,38 A24,30;B27,38 A24,30;B27,38HLAHLA

29、的遗传的遗传 66A2A2 A30A30A2A2 A30A30B13B13 B38B38B38B38 B13B13A11A11 A24A24A11A11 A24A24 B8B8 B27B27B27B27 B8B8A2 A2 A11A11B13B13 B27B27A2 A2 A24A24B13B13 B8B8A30A30 A11A11B38 B38 B27B27 A2,11;B13,27 A2,11;B13,27 A2,24;B8,13 A2,24;B8,13A30 A30 A24A24B38 B38 B8B8 A11,30;B27,38 A11,30;B27,38 A24,30;B8,38 A

30、24,30;B8,38HLAHLA的遗传的遗传 A2,30;B13,38 A11,24;B8,27A2,30;B13,38 A11,24;B8,27 67A2A2 A30A30A2A2 A30A30B13B13 B38B38B38B38 B13B13A11A11 A24A24A11A11 A24A24 B8B8 B27B27B27B27 B8B8A2A2 A11A11B38B38 B8B8A2A2 A24A24B38B38 B27B27A30A30 A11A11B13B13 B8B8 A2,11;B8,38 A2,11;B8,38 A2,24;B27,38 A2,24;B27,38A30A30

31、 A24A24B13B13 B27B27 A11,30;B8,13 A11,30;B8,13 A24,30;B13,27 A24,30;B13,27A2,30;B13,38 A11,24;B8,27A2,30;B13,38 A11,24;B8,27 HLAHLA的遗传的遗传 68A2A2 A30A30A2A2 A30A30B13B13 B38B38B38B38 B13B13A11A11 A24A24A11A11 A24A24 B8B8 B27B27B27B27 B8B8A2 A2 A11A11B38B38 B27B27A2 A2 A24A24B38B38 B8B8A30A30 A11A11B1

32、3B13 B27B27 A2,11;B27,38 A2,11;B27,38 A2,24;B8,38 A2,24;B8,38A30A30 A24A24B13B13 B8B8 A11,30;B13,27 A11,30;B13,27 A24,30;B8,13 A24,30;B8,13HLAHLA的遗传的遗传 A2,30;B13,38 A11,24;B8,27A2,30;B13,38 A11,24;B8,27 69 A2,11;B8,13 A2,11;B8,13 A2,24;B13,27 A2,24;B13,27 A11,30;B8,38 A11,30;B8,38 A24,30;B27,38 A24,

33、30;B27,38 A2,11;B8,38 A2,11;B8,38 A2,24;B27,38 A2,24;B27,38 A11,30;B8,13 A11,30;B8,13 A24,30;B13,27 A24,30;B13,27 A2,11;B27,38 A2,11;B27,38 A2,24;B8,38 A2,24;B8,38 A11,30;B13,27 A11,30;B13,27 A24,30;B8,13 A24,30;B8,13 A2,11;B13,27 A2,11;B13,27 A2,24;B8,13 A2,24;B8,13 A11,30;B27,38 A11,30;B27,38 A24,

34、30;B8,38 A24,30;B8,3816种理论表型HLAHLA的遗传的遗传 70单倍型（haplotype）是指一条染色体上HLA各基因座的基因紧密连锁组成的基本遗传单位。在HLA遗传过程中，单倍型作为一个完整的遗传单位由亲代传给子代。p单倍型遗传HLAHLA的遗传的遗传71A11Cw3B27DR5A1Cw2B8DR3A2Cw2B44DR9A11Cw3B27DR5A2Cw2B44DR9A1Cw2B8DR3A24Cw4B51DR2A11Cw3B27DR5A24Cw4B51DR2A1Cw2B8DR3A2Cw2B44DR9A11Cw3B27DR5A24Cw4B44DR2子1子2子3子4子5(重

35、组)HLA单倍型遗传图A24Cw4B51DR272亲子之间一定共有一条单倍型,即HLA半相同。同胞之间则存在三种情况:完全相同、HLA不相同及HLA半相同。有1/4机会HLA单倍型完全相同；有1/4机会HLA单倍型完全不同；有1/2机会一半相同，即共有一个单倍型。p单倍型遗传HLAHLA的遗传的遗传731/41/41/41/4 半相同：1/2 完全相同：1/4 完全不相同：1/4 7475p连锁不平衡处于Hardy-Weinberg平衡时，不同基因座的基因组成一个单倍型的频率等于各基因频率的乘积。实际观察到的有些单倍型观察频率高于期望频率或低于期望频率，这种现象称为连锁不平衡（linkage

36、disequilibrium）。HLAHLA的遗传的遗传76如：Al B8 Al-B8 Al B8 Al-B8 0.12 0.17 0.12 0.17 预期 （0.l2XO.170.l2XO.17）0.020.02 实际 0.09 0.09 p连锁不平衡HLAHLA的遗传的遗传 处于连锁不平衡状态说明HLA不同基因座的基因之间存在关联，具有一同遗传的趋向。77p HLA遗传特征 共显性遗传 单倍型遗传 连锁不平衡HLAHLA的遗传的遗传78HLA分型血清学分型血清学分型：微量淋巴细胞毒试验，主要用于检测 HLA-A、B、C、DR和DQ基因座的抗原。细胞学分型细胞学分型：淋巴细胞培养试验，主要检

37、测HLA-D和 DP基因座的抗原DNADNA分型分型；可检测HLA所有等位基因pHLA分型方法可归纳为3类：79 或称补体依赖的细胞毒试验，首先由Terasaki在 1 9 6 4 年 建 立，后 经 美 国 国 立 卫 生 研 究 院（National Institute of Health,NIH）标准化，故又称NIH技术。血清学分型p微量淋巴细胞毒试验80分型原理：淋巴细胞膜上的HLA抗原与已知HLA血清中相应抗体结合后，形成抗原抗体复合物，再结合补体。被激活的补体系统产生细胞毒性，攻击并破坏淋巴细胞。经过染色，染料进入破损细胞内着色，为阳性结果。如果抗原与抗体未结合成抗原抗体复合物，则

38、不能结合补体，细胞膜完整，染料无法进入细胞内，为阴性结果。血清学分型p微量淋巴细胞毒试验81步骤血清学分型1淋巴细胞分离：A、B、C抗原检测用混合T、B淋巴细胞。DQ、DR抗原检测用B淋巴细胞。2.用Terasaki液调细胞浓度至2.0106个/ml 82血清学分型3微量淋巴细胞毒试验1）冰箱取出HLA分型板及补体复温。2）于每孔中加1l细胞悬液混合，最后加阳性对照。3）若作HLA-A、B、C分型，在室温下卵育30min；若作HLA-DR、DQ分型，在室温孵育60min。4）加5l补体，混合。5）若作HLA-A、B、C分型，在室温下孵育60min；若作HLA-DR、DQ分型，在室温孵育120m

39、in。6）每孔加3l的5%伊红水溶液，染色58min。加5l 12.3%甲醛，终止反应。7）放入冰箱湿盒内静置12h或过夜。83血清学分型4.结果判读 在倒置相差显微镜下观察，计数着色细胞即死细胞所占细胞数目的百分比。一般认为死细胞20%为阳性反应，即表示该细胞膜上有与抗体相应的抗原。反之，无此种抗原。84血清学分型4.结果判读淋巴细胞毒试验记分标准死细胞（%）记分意 义0101阴性11202可疑阳性21404弱阳性反应41806阳性反应811008强阳性反应85血清学分型p需要注意的问题：在检测HLA抗原的过程中，凡受到细菌、真菌的污染，会使结果不正确。操作时间过长、温度过低或过高亦会影响试

40、验结果的准确性。86血清学分型如果个体只检测出一个抗原，称为存在一个空白抗原，不能判断为一定是纯合子。例如A1，记作HLA-A1，。三种的可能原因：是该抗原的纯合子HLA抗血清板不完全，缺少针对某抗原的抗体,漏检了一个抗原。存在一种至今尚未发现的抗原。87血清学分型：HLA抗体产生途径有以下几种：通过妊娠、输血、同种器官移植等免疫作用，产生同种抗体。用纯化的HLA抗原免疫动物，产生异种抗体。用杂交瘤技术，制备单克隆HLA抗体。偶有“天然”HLA抗体。大多数HLA抗体是免疫抗体，属IgG，少数为IgM。pHLA抗体88血清学分型：根据与抗原决定簇的反应，HLA抗体分为2组：pHLA抗体 1抗体仅

41、与一种HLA基因产物反应。这些抗体只与独有的表位结合，这些表位是单一的HLA等位基因产物。2抗体能与不止一种HLA基因产物结合。这种抗体与结构类似的独有表位或几种HLA基因产物的共有表位结合，产生血清学交叉反应。89血清学分型：原因：HLA抗原由同一个分子上高度关联的若干表位组成，这些表位具有不同的免疫原性，可以刺激产生不同的 同种抗体；两个结构类似的抗原决定簇可以与同一抗体结合；HLA的交叉反应可能是由“复合抗体和复合抗原”引起。p交叉反应90血清学分型：HLA抗血清与交叉反应 HLA-A基因座交叉反应 91血清学分型：HLA抗血清与交叉反应 HLA-B基因座交叉反应 92血清学分型：HLA

42、抗血清与交叉反应 HLA-DR基因座交叉反应 93血清学分型 HLA血清学分型的关键是HLA抗血清。不易获得特异抗血清，抗血清交叉反应明显商品HLA分型板血清种类少94细胞学分型细胞学分型p 采用淋巴细胞培养试验HLA-D与DP抗原特异性可分别通过纯合子分型细胞及预致敏淋巴细胞试验检测。两种方法均以混合淋巴细胞培养（MLC）为基本技术，通过测定淋巴细胞在识别非己HLA抗原后发生的增殖反应来分型。由于分型细胞来源困难以及操作手续繁琐，细胞学分型已渐被淘汰。95DNA分型届数 年份 主 要 内 容 第十一届 1991年 确定了146种HLA抗原，建立了HLA II类的PCR-SSCP分型标准，并明

43、确今后凡确定新的血清学特异性，均需有DNA序列分析及氨基酸序列分析的资料 第十二届 1996年 研究HLA在DNA水平的变异及其免疫学功能，建立了HLA I类分子生物学分型方法 第十三届2002年进一步研究HLA在DNA水平的变异及其生物学功能，建立了标准化HLA DNA测序的分型方法96p针对核苷酸序列差异而设计DNA分型PCR-RFLPPCR-SSO(ASO)PCR-MPH PCR-SSP序列测定97p DNA分型方法优于血清学方法之处：DNA分型1.便于标准化和相互比较结果2.对检材要求不高3.血清学和DNA分型不完全相同的分型误差得以解决98HLA的群体分布p不同人群的HLA抗原分布有

44、很大的差异，可能提供某些有关人类迁移和混杂的信息。99A1A2A3A9A10A11A28A29A30A31A32A33空白空白合计合计B512862712421161523291111618B7452117341276811112237B8172891161111111179B1215591711111115195B1313178257414442795065811090514B8118111121111127B1548160115586914181381271511303B16125958641318811458122625B17321210633137151110683292381009B

45、181411416111711544B21111111111111113B223242110725188101144155606B271221422481101921111188B351981341134681211613244B37911111111911129B40153033436962363224177451201820B461852711031915216152111847空白空白65496127540342111111321311合计合计1662994239151324630191241591103304544960610000中国北纬30度以南人群HLA-AB单倍型频率(10-4

46、,N=580)100在亲子鉴定中的应用在亲子鉴定中的应用 p否定父权单独使用HLA分型，非父排除概率可达到90%左右，超过使用ABO、MN、Rh等11个红细胞血型系统及Gm、Km、Hp等8个血清型系统的总排除概率。101否定父权(逐个座位分析)AF1 HLA-A2,11AF1 HLA-A2,11；B13,-B13,-；Cw4,w6Cw4,w6；DR13,15DR13,15；DQ7,9DQ7,9AF2 HLA-A2,30AF2 HLA-A2,30；B46,60B46,60；Cw4,w6Cw4,w6；DR12,13DR12,13；DQ5,9DQ5,9AF3 HLA-A11,30AF3 HLA-A1

47、1,30；B35,46B35,46；Cw1,w4Cw1,w4；DR9,15DR9,15；DQ4,7 DQ4,7 M HLA-A11,M HLA-A11,2424；B13B13,46,46；Cw3Cw3,w4,w4；DR4DR4,15,15；DQ6DQ6,7,7C HLA-C HLA-A24A24,3030；B13B13,3535；Cw1Cw1,w3w3；DR4DR4,9 9；DQ4DQ4,6 6 在亲子鉴定中的应用在亲子鉴定中的应用 102在法医数据分析中，HLA不同基因座的累积概率不能简单使用各基因频率的乘积，而应该用单倍型频率，否则会导致过高或过低估计HLA系统的鉴定能力。以单倍型频率作为父权指数的计算依据。p确信父权在亲子鉴定中的应用在亲子鉴定中的应用 103致 谢：感谢为本课件提供图片等资料的所有网站、机构和个人!