深部真菌感染的实验室诊断课件.pptx

1、1深部真菌感染的实验室诊断北京朝阳医院 谷丽2教师简介 毕业于北京协和医院，获呼吸内科医学博士学位。2012-2013年于美国西北大学医学院做访问学者一年 首都医科大学朝阳医院感染和临床微生物科副主任 中华医学会北京感染分会委员 从事感染性疾病临床和科研工作，包括呼吸道感染、复杂泌尿系感染、中枢神经系统感染、血流感染、皮肤软组织感染、免疫缺陷（器官移植术后、激素和免疫抑制剂应用后）继发感染，以及复杂性不明原因发热等贴照片处（照片尺寸9.46.8cm）谷丽主任医师3导读疾病常伴有真菌感染，病原学的实验室诊断非常重要，而真菌诊断仍面临挑战。临床常用的诊断方法有直接镜检、真菌培养、结合抗原抗体。临床

2、医生需要结合临床影像微生物证据来确诊并给予合适的治疗4学习目标深部真菌感染的实验室诊断方法掌握每种诊断方法的临床应用5内容概况真菌感染基本概念 致病性分类 形态分类 致病途径实验室诊断方法及临床应用 直接镜检 真菌培养 抗原抗体检测 分子诊断（PCR）临床病例分享6按照真菌致病性的分类 原发致病性真菌 致病性真菌本身具有很强的致病性，可使免疫正常宿主致病如：组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌着色真菌、足分支菌、孢子丝菌等 多呈地区性流行南北美洲 条件致病性真菌占主要地位，呈上升趋势 正常情况下不致病，在特定条件能引起疾病，通常是在机体的局部或全身免疫功能降低病菌寄居部位的改变7

3、按照真菌生长的形态分类 霉菌（molds）：多细胞真菌，包含分支的管状结构菌丝环境中生长时，形成菌丝体，如曲菌、毛霉菌。繁殖方式：孢子形成 酵母菌（yeasts）：单细胞真菌，呈圆形或卵圆形，如新型隐球菌以出芽方式进行繁殖。有些可以形成假菌丝（如白色念珠菌）双相真菌（dimorphicfungi）：可以酵母菌和霉菌两种形式存在。环境中以霉菌形式生长，孢子入侵人体后，以酵母菌样形式生长。如组织胞浆菌、马尼菲青霉菌37 C 酵母相27 C 菌丝相烟曲霉菌酵母菌8致病途径真菌在自然界广泛存在：吸入空气中的真菌孢子可引起支气管肺部感染，并可经淋巴或血液途径播散至其它脏器经皮肤或粘膜屏障破损处进入人体皮

4、肤软组织、眼睛、关节等，也可以引起血流感染微生物学证据深部真菌感染的诊断需要考虑宿主因素免疫状态临床诊断确诊相应的临床症状/体征/影像学 拟诊只 组织病理学证据和无菌有 体液的镜检和培养阳性定植910真菌体外病原学检测方法 标本的直接涂片 血或分泌物或病变组织培养 组织病理 血清学检测 G，GM 隐球菌抗原，念珠菌抗原 曲霉菌IgG，念珠菌IgG 取血或分泌物做PCR11临床医生怀疑鉴别诊断答案疑问微生物标本送检敏感性？特异性？临床意义？微生物结果解读的困惑耗时:镜检:实时 胶体金:15分钟 GM：3小时 培养：48小时涂片镜检（革兰染色、KOH浮载剂镜检、HE染色、Giemsa染色、GMS染

5、色、六胺银染色）痰液、ETA、BALF、PSB采标本、支气管粘膜肺活检标本其他组织标本黏蛋白卡红染色镜检发现隐球菌、六胺银涂片镜检发现人肺孢子菌具有确诊价值。KOH浮载剂镜检可以发现丝状真菌有重要临床意义，是真菌病的强指征发现孢子/假菌丝通常指念珠菌，无临床意义真菌培养痰、ETA、BALF、PSB标本、胸腔积液、支气管粘膜活检标本、肺活检或其他组织标本、血液，关节液，脑脊液等无菌体液采用无菌技术从通常无菌部位采集的标本培养阳性是诊断的金标准非无菌标本应注意除外定植或污染12真菌的形态学检测呼吸道标本相关检测BAL：肺泡灌洗液；#:镜检阳性是感染的强指证；$:细菌平板培养的敏感性低于真菌平板培养

6、；*：PCR的敏感性高于培养13检测直接镜检找菌丝#真菌培养（痰培养或肺泡灌洗液）$组织标本病理真菌培养（经胸吸引物）曲霉PCR（气道分泌物）*细菌培养（痰液或肺泡灌洗液）推荐强度AAABCC证据等级IIIIIIIIIIIIIt14真菌直接涂片KOH压片400痰等呼吸道标本中发现孢子/假菌丝通常指念珠菌，无临床意义15可见真菌孢子及假丝（念珠菌）可见真菌孢子未见假丝（念珠菌）无菌体液真菌直接涂片可以确诊1000100016找到真菌菌丝（丝状真菌，如曲霉、毛霉）有重要临床意义 有隔菌丝，45分枝：曲霉菌属 无隔宽大菌丝：90分枝毛霉菌目革兰染色1000400棉兰染色六胺银染色KOH压片17直接涂

7、片镜检发现隐球菌可以确诊墨汁染色革兰染色40010001000六胺银染色18肺泡灌洗液痰六胺银染色发现人肺孢子菌可确诊1000100019 男，75岁，糖尿病 主诉：间断发热、咳嗽20天，加重伴气短3天病例分享气道吸出物培养：烟曲霉20女，31岁，咳嗽伴活动后气短1月。肾病综合征激素治疗六胺银染色：PCP21 男，35岁，糖尿病，咳嗽伴发热2月 WBC 7.52x109/L,Neu 82%，LY12.5%BALF涂片：隐球菌BALF真菌培养：新型隐球菌 男，45岁，咳嗽、咳痰、喘憋伴高热，声音嘶哑20余天。无基础病，农民 接触史：近期暴露霉变玉米 WBC 29.5109/L，N%91.4%亚胺

8、培南治疗无效 痰培养：烟曲霉（05-06、05-07、05-09）TBIL：肺泡结构大致正常，肺泡腔可见少量吞噬细胞聚集。局部可见坏死及炎症性纤维素渗出，周围可见少量真菌及脱落的支气管上皮免疫力正常宿主吸入大量孢子2223尖端赛多孢子菌播散性感染 男，27岁，管路维修工 污水管路爆炸，吸入污水7分钟，意识不清5小时就诊 既往体健3.33.53.1024 痰：奇异变形杆菌，MRSA，绿脓杆菌，头地霉2，光滑念株菌3 关节液细菌和真菌培养：阴性 G试验 900pg/ml（20pg/ml）25右膝关节穿刺：关节液血培养（5月3日）沙保罗培养基：白色棉花状，菌落中心有黑心镜下菌丝分隔，分生孢子卵圆型，

9、着生于分子孢子梗顶端（尖端赛多孢子菌）（棉酚蓝染色 400）沙氏27沙氏35马内菲青霉26血培养涂片10001000病例：免疫缺陷马内菲青霉女，23岁，广西人。“间断发热20天，伴高热、寒战”27 最简单、快速、实用的诊断方法：12h可以报告结果 可为感染性疾病早期诊治提供病原性依据 可提高慢生长细菌的阳性检出率 合格标本是提高直接镜检敏感性和特异性的关键 积极进行无菌体液的真菌培养真菌直接镜检和培养小结28侵袭性真菌感染的生物标记物（免疫学方法）泛真菌 1,3-D-葡聚糖（抗原G试验）曲霉菌 半乳甘露聚糖（抗原GM）抗体（IgG/IgM/IgE）胶体金 念珠菌 甘露聚糖（抗原）抗甘露聚糖抗体

10、 念珠菌胶体金（Directigen 123）曲霉菌病念珠菌病敏感性特异性敏感性特异性引用文献77%无记录75无记录Karageorgopoulos.CID2011;15;5:750-7076%85%8181Lu.InternalMed201177%83%8181Onishi.JCM2012;50:7-15291-3-D葡聚糖（G试验）酵母菌和丝状真菌细胞壁成分 泛真菌 肺孢子菌肺炎患者含量高Odabasi.CID 2004;5;39:199-205.Pickering.JCM 2005;43:5957-62.Ostrosky-Zeichner.CID 2005;41:654-9.患者患者敏感

11、性敏感性,%(95%CI)特异性特异性,%(95%CI)血液恶性肿瘤58(5264)95(9496)造血干细胞移植65(6078)65(4483)实体器官移植41(2164)85(8089)半乳甘露聚糖（GM）半乳甘露聚糖（GM）试验已经过一些Meta分析的评估12，用不同的cut-off值来确定阳性 相较于接受实体器官移植的患者，GM试验更适用于接受重度化疗的患者1.Mennink-Kersten MA,et al.LancetInfect Dis 2004;4:349572.Leeflang MM,et al.CochraneDatabase Syst Rev 2008;8:CD00739

12、4不同基础疾病下敏感性不同 诊断驱动治疗策略：每3-4天进行GM监测，并结合临床和微生物学评价，以及高分辨率CT影像学（AII 建议）3031肺泡灌洗液GM试验侵袭性肺曲霉菌感染敏感性9090特异性9496.4引用文献Guo,Chest 2010Avni,JCM 2011;4:665-7087929498Zou,PlosOne 2012;7:e52833Heng,Crit Rev Microbiol2015;41:124-34(haematological patients)Cut-off：0.5GM对慢性肺曲霉病诊断的贡献 肺泡灌洗液GM抗原检测在取0.7为折点时，对慢性肺曲霉病诊断的敏感性

13、和阳性率是66.7%和63.5%。当取折点为0.4的时候，肺泡灌洗液GM检测的敏感率和特异性约为77.2%和77.0%在另一个研究中，在折点0.5时肺泡灌洗液的GM抗原检测敏感性和特异性为85.7%和76.3%近期的一个研究血清GM的敏感性仅为23%。因此BAL（SoR B,QoE II）GM应该被用于慢性肺曲霉病的诊断而非血清（SoR C and QoE III）GMSoR：推荐强度；QoE：循证等级；BAL：肺泡灌洗液32人群空腔或结节非免疫抑制患者肺部渗出目的诊断和排除慢性肺曲霉病备注抗原检测涉及灌洗液和血清，但不包含痰液措施BAL 抗原血清 抗原SoRBCQoEIIIIRef.3828

14、，38，39痰液 抗原无数据33曲霉抗体检测 曲霉特异性抗体检测是慢性肺曲霉病的一个关键诊断。感染患者和定植患者可以通过曲霉特异性抗体的不同表现加以区分，诊断感染的阳性预测值（PPV）为100%所有患者怀疑慢性或亚急性侵袭性曲霉病均应进行曲霉特异性抗体IgG或曲霉沉淀素检测 烟曲霉特异性抗体IgE检测（尤其是在哮喘囊性纤维化患者中和ABPA）2015年慢性肺曲霉病：诊断和疾病管理理论说明以及临床指南iACPAABPAGM62%220%IgG65%100%65%IgE0%66%100%34曲霉菌抗体检测 IA：侵袭性曲霉病 CPA：慢性肺曲霉病 ABPA：过敏性支气管肺曲霉病 基于6.3万IA，

15、24万CPA和88.7万ABPAPage.Medical Mycology 2015曲霉抗原曲霉特异性IgG曲霉特异性IgE抗体检测诊断曲霉病现状与展望3552岁，2007年肺结核咳嗽咳痰 2年，口服伊曲康唑一年好转，再次加重半年，抗结核治疗无效曲霉菌IgG 106Au/ml肺结核继发慢性肺曲霉菌病病例分享36女，45岁2009年，因虹膜炎糖皮质激素治疗好转2011年，因干咳就诊，发现肺内阴影，胸腔镜肺活检病理诊断结节病，拒绝激素治疗，每年随访2016年10月份开始咳嗽明显加重，干咳为主，无发热，盗汗，伏立康唑治疗10天，后出现咯血，考虑肺结核，患者就诊结研所结节病合并慢性肺曲霉菌病2016年

16、11月-12月在结研所住院，痰及支气管镜BALF抗酸涂片，分枝杆菌培养和GeneXpert均阴性。颈部淋巴结活检提示上皮样肉芽肿改变，未见坏死，首先考虑结节病。考虑影像学仍不能除外肺结核，抗结核治疗（HRZE，后HRELfx）治疗4周无效，咳嗽，气短加重SACE 37.6IU 嗜酸达16%372016.112014.438曲霉IgE 1.58KIU/L（2级）总IgE 1127KIU/L曲霉IgG500Au/ml 血GM0.13伏立康唑 200mg Bid 2个月强的松 30mg/d39其它用于鉴别真菌病的血清学方法 侵袭性念珠菌病：甘露聚糖抗原/甘露聚糖抗体联合检测法抗原抗体联合检测敏感性和

17、特异性为83%和86%隐球菌：荚膜抗原检测（乳胶凝集，胶体金）G试验检测范围：个例报道组织胞浆菌、尖端赛多孢、链格孢、枝顶孢，镰刀菌40 简单、快速、实用的诊断方法 G，GM结果解读需要密切结合临床，建议高危人群动态监测 BALF的GM测定敏感性和特异性比血清GM高 曲霉菌抗体IgG用于诊断慢性肺曲霉菌感染 曲霉菌抗体IgE用于诊断变应性支气管肺曲霉菌病血清学方法小结实验室结果慢性肺曲霉病烟曲霉培养阳性率7/42（16.7%）曲霉菌属qPCR检测阳性率30/42（71.4%）41Denning et al.Clin Infect Dis 2011;52:1123痰标本中曲霉菌的分子检查敏感性高于培养。感染和高真菌负荷的患者通常信号强度是强的在抗真菌治疗过程中检测出强PCR信号多数与抗真菌耐药相关。同时在技术层面上能够直接诊断关键的耐药突变分子诊断方法（PCR）42分子检测局限性 污染！采血管 运储时间：人DNA酶和RNA酶可能降解病原体游离DNA 几乎所有的商业化检测 仅供科学研究 仅限研究目的 缺乏验证 不可作为单一检测使用 检测结果应谨慎考虑 “分子检测方法不能完全替代培养、镜检及临床检查（病史、体征和症状），但它是很有价值的补充诊断方法”43总结 真菌诊断仍面临挑战 病原学的实验室诊断非常重要 重视直接镜检 真菌培养 结合抗原抗体 临床影像微生物证据44谢谢！