海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析课件.ppt

1、海洋贝类腺体内五种游离生物激素的海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源负化学源GCMSGCMS连续分析研究连续分析研究徐继林 严小军 叶芳挺 刘才才 宁波大学 浙江省海洋生物工程重点实验室 贵阳 2004.9.23 目的意义n生物激素对生物体的生长发育和繁殖有着重要的生物学意义。对海洋贝类而言，主要有两类物质，一类是直接作用于相关受体的小分子物质包括肾上腺素（L-Epinephrine,EPI）、去甲肾上腺素（L-Norepine phrine,NEPI）和多巴胺（Dopamine,DOP）等；另一类是甾醇类激素如17-雌二醇（17-Estradiol,EST）和孕酮(Progesteron

2、e,PG)等，它们通过调控第一类物质的合成代谢和分泌对生物体起生殖调控作用。n为了解它们在生物体内的合成代谢途径以及从环境中富集的程度大小，需要对它们在生物体内含量进行准确灵敏的测定。由于它们在生物体内含量很小，而研究过程中生物样品数量也很少，所以如果能够将它们通过一定的方法一次性测定出来将有很重要的现实意义。n已经有大量生物体体液或组织中的激素测定报道，但大多是针对某种激素或是一类激素的研究，还未见将上述两类激素一次性连续测定的报道。负离子化学（Negative Chemical Ion,NCI）源的气相色谱质谱联用（GC/MS）分析对具有强电子亲和力的化合物有着较高的灵敏度。本研究建立了N

3、CI源气相色谱质谱联用检测海洋贝类腺体内5种激素的连续分析方法，以期为研究激素在贝类生物体内的调控作用提供方便灵敏的检测手段 材料与方法 实验材料实验材料n 实验试剂 激素标准品（纯度98%，美国SIGMA-ALDRICH公司）；七氟丁酸酐（Heptafluorobutyric Anhydride,HFBA,）(美国Alltech公司）；乙酸乙酯（色谱纯，美国TEDIA公司）；其他试剂均为国产分析纯。实验材料n 实验仪器 QP2010 型 GC-MS 联用分析仪，带 AOC-20 自动进样器（日本 SHIMADZU 公司）；30m0.25mm 0.25 m SPB-1色谱柱（美国 SUPELC

4、O 公司）；固相萃取装置（美国 SUPELCO 公司），C18固相萃取小柱（美国 SUPELCO 公司），冷冻干燥机（韩国ILSHIN公司），超纯水仪（法国MILLIPORE公司）。另外，国产高速分散匀质机、旋转蒸发仪、旋涡混合仪、高速离心机、电子天平等。实验材料n实验样品 2004年3月购自宁波市场的鲜活野生一龄曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni）和一龄野生褶牡蛎（Ostrea plicatula），解剖后取性腺，用高速分散匀质机匀浆后冷冻干燥备用。回收率实验采用缢蛏(Sinonvacula constricta)肌肉样品，高速分散匀质机匀浆冷冻干燥后备用。标准溶液配制标准溶

5、液配制 20.0 20.0 mg mg 激素标准品激素标准品酸性甲醇(0.1mol/L HCl)4.0mL 5 mg/mL的的标准贮备液标准贮备液 制作工作曲线时再取此储备液用制作工作曲线时再取此储备液用甲醇甲醇配制成其他浓度的标准溶液。配制成其他浓度的标准溶液。样品预处理样品预处理0.10.1g g 左右样品左右样品 0.5 mL 7 mol/L的甲酸 涡旋震荡2 min、超声抽提5 min4000 rmin 离心5 min 上层液上层液0.5 mL 7 mol/L的甲酸重复抽提2次合并上层液合并上层液1.5 mL 7 mol/L 氨水4000 rmin 离心5 min上层液上层液0.1mL

6、/min C18 C18 固相萃取柱固相萃取柱 3 mL 去离子水淋洗 3 mL 80%丙酮水溶液洗脱 旋转蒸发 40水浴 干干50 L HFBA衍生剂 130油浴20 min 氮气吹近干近干乙酸乙酯/醋酸酐定容 1:1(V/V)1.0 1.0 mLmL GC/MS分析GC/MSGC/MS定量定性分析定量定性分析 1.分析条件分析条件GC条件：条件：进样口温度进样口温度250，载气为，载气为99.999%的的高纯氦，总流速高纯氦，总流速20 mL/min,柱流速柱流速1.50 mL/min,柱前压柱前压112.4 kPa,柱起始温度柱起始温度100，保持保持3.5 min，以以20/min升至

7、升至120 后以后以2/min升至升至150，再以，再以25/min升至升至280 保保持持10 min。不分流进样不分流进样1 L。GC/MSGC/MS定量定性分析定量定性分析 1.分析条件分析条件MS条件：条件：采用采用NCI源源分析，反应气为分析，反应气为甲烷甲烷，离子源温度，离子源温度200，接口温度，接口温度250，选取全程离子碎片扫描（，选取全程离子碎片扫描（SCAN）模式模式时，质量扫描范围为时，质量扫描范围为1501000。选取特征离子碎片扫描。选取特征离子碎片扫描（SIM）模式时，模式时，NEPI选择选择m/z 541、953和和 213作为特征碎作为特征碎片离子；片离子；D

8、OP选择选择m/z 543、721和和 476作为特征碎片离子；作为特征碎片离子；EPI选择选择m/z 770、558和和 213作为特征碎片离子；作为特征碎片离子；EST选择选择m/z 644、428和和 197作为特征碎片离子；作为特征碎片离子；PG选择选择m/z 490、470和和 178作为特征碎片离子；每组特征碎片离子中，前一个作为特征碎片离子；每组特征碎片离子中，前一个离子作为定量时的目标离子，后两个离子作为定性时的参考离子作为定量时的目标离子，后两个离子作为定性时的参考离子。离子。GC/MSGC/MS定量定性分析定量定性分析 2.定性分析定性分析 保留时间保留时间:相同的色谱条件

9、下与标准色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中激素类化合物 五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图 20.022.525.00.05.010.0(x1,000,000)NEPIDOPEPIESTPGSCANSCAN20.022.525.027.50.00.51.0(x1,000,000)NEPI DOPEPIESTPGSIMSIM保留时间Ret.Time(min)信号强度 Intensity20.022.525.00.05.010.0(x1,000,000)NEPIDOPEPIESTPG20.022.525.00.05.010.0(x1,000

10、,000)20.022.525.00.05.010.0(x1,000,000)NEPIDOPEPIESTPGSCANSCAN20.022.525.027.50.00.51.0(x1,000,000)NEPI DOPEPIESTPGSIMSIM20.022.525.027.50.00.51.0(x1,000,000)20.022.525.027.50.00.51.0(x1,000,000)20.022.525.027.50.00.51.0(x1,000,000)NEPI DOPEPIESTPGSIMSIM保留时间Ret.Time(min)信号强度 IntensityGC/MSGC/MS定量定性分

11、析定量定性分析 2.定性分析定性分析 质谱图质谱图:2505007500.025.050.075.0100.0213541194953756214408 523NEPI2505007500.025.050.075.0100.0543476721505677722408178347506682741150DOP2505007500.025.050.075.0100.0 213770194558750687359947EPI2505000.025.050.075.0100.0 197178644428485160375560EST2003004005000.025.050.075.0100.049

12、0178194470150488198166269PG相对丰度 Relative abundence(%)质/荷m/z2505007500.025.050.075.0100.0213541194953756214408 523NEPI2505007500.025.050.075.0100.0543476721505677722408178347506682741150DOP2505007500.025.050.075.0100.02505007500.025.050.075.0100.0 213770194558750687359947EPI2505000.025.050.075.0100.0

13、 197178644428485160375560EST2003004005000.025.050.075.0100.0490178194470150488198166269PG相对丰度 Relative abundence(%)质/荷m/z5 5种激素的种激素的HFBIHFBI衍生物衍生物NCINCI源的质量谱图源的质量谱图 GC/MSGC/MS定量定性分析定量定性分析 3.定量分析定量分析 根据样品中所含各激素的特征离子信号响应强度，用外标法求出各激素的含量。GC/MSGC/MS定量定性分析定量定性分析 4.4.回收率、精密度测回收率、精密度测定定向0.1g 未检出激素的缢蛏肌肉干样中分别

14、加入激素各50 ng，按照上述分析条件测定该样品中各激素的含量，平行测定三次。得方法的回收率和精密度。结 果工作曲线 5 5 种激素的线性方程种激素的线性方程 激素 Hormone 线性方程 Calibration equation 回归系数 Regression coefficie nt 浓度范围（ng/mL）Range of concentration NEPI Y=653 X 0.9942 2.5200.0 DOP Y=564 X 0.9993 2.5200.0 EPI Y=1035 X 0.9955 2.5200.0 EST Y=1606 X 0.9998 2.5200.0 PG Y=

15、85 X 0.9999 2.5200.0 回收率和精密度 表表 2 2 5 5 种种激激素素回回收收率率的的测测定定结结果果 Tab.2 Result of recovery of 5 hormones%激素 回收率 1 回收率 2 回收率 3 均值 相对标准偏差 Hormone recovery 1 recovery 2 recovery 3 XSD RSD(%)NEPI 44.1 52.34 38.88 45.115.54 12.28 DOP 34.44 25.76 28.52 29.573.62 12.24 EPI 61.44 72.92 88.56 74.3111.12 14.96 E

16、ST 14.84 10.45 19.22 14.843.58 24.13 PG 26.16 33.32 19.89 26.465.49 20.74 检测限 根据性噪比为3，用QP2010气相色谱-质谱分析仪随机所载SNRATIO软件，可计算出各标准物浓度为2.5 ng/mL的信噪比，从而根据式MDL=3CN/S计算出仪器的检测限方法的检测限：方法的检测限：表表 3 5 5 种激素的检测限种激素的检测限 Tab.3 The detection limit of 5 hormone compounds 激素 信噪比 检测限 Hormone S/N MDL(ng/mL)NEPI 9.5 0.79 D

17、OP 57.9 0.13 EPI 29.5 0.25 EST 58.5 0.13 PG 775.0 0.01 5种激素的仪器检测限均小于1ng/mL样品中激素的含量 n取0.1 g 左右曼氏无针乌贼和野生褶牡蛎的性腺按上述条件平行测定3次(表4)，各激素含量在未检出到17.92 ng/g 范围内。表表4 两两种种贝贝类类性性腺腺中中5种种激激素素的的含含量量 Tab.4 Content of five hormone compounds in two shells ng/g 激素 Hormone NEPI DOP EPI EST PG 曼氏无针乌贼Sepiella maindroni 1.48

18、 ND 0.24 0.12 ND 褶牡蛎 Ostrea plicatula 2.16 17.92 1.84 0.56 0.06 注：ND指在本方法的仪器检测限下未检出。Notes:ND not detected at the detection level of the method 讨 论 衍生条件的选择 由于各种激素分子上都带有两个以上的可衍生基团，所以在不同的温度条件下会有不同的衍生方式，而衍生时间又会影响衍生程度。在过低的温度下过短的时间衍生往往不很充分选择130油浴20 min过长时间过高温度条件又会带来较多的副产物而影响方法的灵敏度 五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图五种

19、激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图 20.022.525.00.05.010.0(x1,000,000)NEPIDOPEPIESTPGSCANSCAN20.022.525.027.50.00.51.0(x1,000,000)NEPI DOPEPIESTPGSIMSIM保留时间Ret.Time(min)信号强度 Intensity20.022.525.00.05.010.0(x1,000,000)NEPIDOPEPIESTPG20.022.525.00.05.010.0(x1,000,000)20.022.525.00.05.010.0(x1,000,000)NEPIDOPEPIESTPG

20、SCANSCAN20.022.525.027.50.00.51.0(x1,000,000)NEPI DOPEPIESTPGSIMSIM20.022.525.027.50.00.51.0(x1,000,000)20.022.525.027.50.00.51.0(x1,000,000)20.022.525.027.50.00.51.0(x1,000,000)NEPI DOPEPIESTPGSIMSIM保留时间Ret.Time(min)信号强度 Intensity可见各衍生物都有良好的响应信号可见各衍生物都有良好的响应信号2505007500.025.050.075.0100.02135411949

21、53756214408 523NEPI2505007500.025.050.075.0100.0543476721505677722408178347506682741150DOP2505007500.025.050.075.0100.0 213770194558750687359947EPI2505000.025.050.075.0100.0 197178644428485160375560EST2003004005000.025.050.075.0100.0490178194470150488198166269PG相对丰度 Relative abundence(%)质/荷m/z250500

22、7500.025.050.075.0100.0213541194953756214408 523NEPI2505007500.025.050.075.0100.0543476721505677722408178347506682741150DOP2505007500.025.050.075.0100.02505007500.025.050.075.0100.0 213770194558750687359947EPI2505000.025.050.075.0100.0 197178644428485160375560EST2003004005000.025.050.075.0100.049017

23、8194470150488198166269PG相对丰度 Relative abundence(%)质/荷m/z5 5种激素的种激素的HFBIHFBI衍生物衍生物NCINCI源的质量谱图源的质量谱图 HNCH3HOOHHOEpinephrine,C9H13NO3,183.20 HOOHNH2HONorepinephrine,C8H11NO3,169.18 HOHONH2 Dopamine,C8H11NO2,153.18 OHCH3HOHHHEstradiol,C18H24O2,272.38.CH3CH3OCH3OHHHProgesterone,C21H30O2,314.46 FCFFCCFFF

24、FCOOFCFFCCFFFFCO197HFBA除除NEPINEPI出现了衍生物的分子离子信号（出现了衍生物的分子离子信号（m/z m/z 953953）外，其他外，其他激素衍生物的激素衍生物的NCI-MSNCI-MS中均未出现分子离子信号，但都出现中均未出现分子离子信号，但都出现了了 M-HF-M-HF-信号（信号（DOPDOP中的中的721721、EPIEPI中的中的947947、ESTEST中的中的644644和和PGPG中的中的490490）,由此也可确定出在所确定的衍生条件下由此也可确定出在所确定的衍生条件下NEPINEPI衍生上了衍生上了4 4个个7 7F F基团，基团，DOPDOP

25、衍生上了衍生上了3 3个个7 7F F基团，基团，EPIEPI衍衍生上了生上了4 4个个7 7F F基团，基团，ESTEST衍生上了衍生上了2 2个个7 7F F基团，基团，PGPG衍生上了衍生上了1 1个个7 7F F基团。基团。提取、纯化条件的选择 提取：DOP、EST、PG最常的的提取溶剂为甲醇，但该研究对象为含脂肪含量很高的生物样品，而且NEPI和 EPI均难溶解于大多有机溶剂 甲醇酸性水NEPI和 EPI可以溶解于酸性水（pH5），少量的DOP、EST和PG也可溶于酸性水（pH=1左右）中 兼顾两者，用有机酸7mol/L甲酸溶液（pH=1左右）提取、纯化条件的选择纯化：NEPI、EP

26、I和DOP这类儿茶酚胺类激素，可用WCX弱离子交换柱富集，再用甲酸洗脱得到良好的回收率（Zamecnik等，1997）。但实验表明固醇类激素在弱极性柱上保留效果不佳 固醇类激素，用C18柱富集，甲醇洗脱后再过硅胶柱，正己烷脱脂肪后用1:1 二氯甲烷/乙酸乙酯洗脱（Casademont等，1996）。但实验表明这一类激素在硅胶柱上损失很大 甲酸溶液提取，氨水中和离心可去除部分蛋白，样品过C18柱后用80%的丙酮水洗脱，可以尽量减少脂类物质的干扰，直接回收率在14.84-74.31%之间，与资料结果（Casademont等，1996）类似。不足 本方法采用本方法采用外标法外标法进行定量分析进行定量分析 对于有着比较复杂前处理的定量分析，为了校正前处理中对于有着比较复杂前处理的定量分析，为了校正前处理中目标化合物的丢失，最好采用目标化合物的丢失，最好采用内标校正内标校正。但由于几种化合物由于几种化合物结构性质相差较大，很难找到一个合适的共同内标。结构性质相差较大，很难找到一个合适的共同内标。国外同行均选择各激素的氢同位素内标，方法回收率可达75%-85%（Zamecnik等，1997；Casademont 等，1996）所以如果也能采取各激素的同位素内标，一定也可以进一步提高方法的回收率欢迎指教欢迎指教 谢谢 谢谢 ！2004.9.23.